把設(shè)計(jì)引物如何設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)這方面的帖子整理一下，因?yàn)樽蛱煲幌伦涌吹饺齻€(gè)相似問題。原帖如下：我想向你求教一個(gè)問題,假如說我想把胰島素基因和腺病毒載體連接起來,如何確定設(shè)計(jì)目的基因PCR時(shí)的引物呢?和相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶呢?謝謝老師能給予講解,謝謝 [整理]：最初的時(shí)候，由于害怕設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)最后且不開，所以經(jīng)常采用最通用的方法，用T載體克隆解決問題，但后來發(fā)現(xiàn)她也有問題，就是濃度提不上去，你需要體大量的載體來酶切，所以感到還是直接擴(kuò)增好一點(diǎn)。但這就需要你仔細(xì)設(shè)計(jì)引物。連入質(zhì)粒中的重要目的就是進(jìn)行酶切和連接，當(dāng)然首先就是在想要合成或者是進(jìn)行PCR擴(kuò)增出靶基因的時(shí)候在核酸的兩端接入酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是與你的質(zhì)粒的特點(diǎn)相關(guān)的，可以在質(zhì)粒的圖譜說明書上找取相應(yīng)的位點(diǎn)，進(jìn)行設(shè)計(jì)。 （一）設(shè)計(jì)引物前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作： 準(zhǔn)備載體圖譜，大致準(zhǔn)備把片斷插在那個(gè)部分 對(duì)片斷進(jìn)行酶切分析，確定一下那些酶切位點(diǎn)不能用 準(zhǔn)備一本所買公司的酶的商品目錄，便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用 （二）設(shè)計(jì)引物所要考慮的問題 兩個(gè)位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，，所連接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，緊挨在一起，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面兩個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)。我看promega的說明書上說，最好隔四個(gè)。還有一種情況是：不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點(diǎn)比較難切。 兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切。 最好使用酶切效率高的。 最好使用雙酶切有共同buffer的酶。 最好使用較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己實(shí)驗(yàn)室有的酶，這樣可以省錢。 Tm的計(jì)算，關(guān)于Tm的問題，很多的戰(zhàn)友都有疑惑。其實(shí)園子里有很多的解釋了。 Tm叫溶解溫度（melting temperature, Tm），即是DNA雙鏈溶解所需的溫度。大家可以理解，這個(gè)溫度是由互補(bǔ)的DNA區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的。因此，對(duì)于引物的Tm，只有和模板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)m才有貢獻(xiàn)。計(jì)算Tm時(shí)，只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū)域（除非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)）。不少戰(zhàn)友設(shè)計(jì)的引物都Tm過低，是因?yàn)樗麄冋`把保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)都計(jì)算到Tm里了，最后的結(jié)果是導(dǎo)致了PCR反應(yīng)的諸多困難。所以，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，先不管5'端的修飾序列，把互補(bǔ)區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據(jù)PCR的具體情況，對(duì)于困難的PCR，需要適當(dāng)提高Tm），再加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。Tm溫度高的引物就比較容易克服3‘發(fā)卡、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。簡(jiǎn)單的計(jì)算公式可以用2+4的公式。若你計(jì)算的Tm值達(dá)到了快90 ，不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn)的。自己可以再估計(jì)一下。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長分別為29、33個(gè)堿基，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分別為17、21個(gè)堿基。引物公司給的單子是70多度，實(shí)際用的只有50度，用55度擴(kuò)的結(jié)果也差不多。 其它關(guān)于Tm值的計(jì)算，有用PP5.0進(jìn)行評(píng)價(jià)的，需要考慮的參數(shù)包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計(jì)算可以不把加入的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn)去，如上所言，PCR幾個(gè)循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會(huì)增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的Primer計(jì)算出來的。1.一般在5'端加保護(hù)堿基,如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時(shí)可以不需加保護(hù)堿基2.有人的經(jīng)驗(yàn)加入酶切位點(diǎn)的引物可以和未加入時(shí)使用相同的退火溫度,結(jié)果也還是令人滿意。 關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對(duì)值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時(shí)可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對(duì)值較大，如果PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的△G。 在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因?yàn)?，一個(gè)特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是28bp左右了。而我們?cè)谠O(shè)計(jì)退火溫度時(shí)，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚 設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，常在5‘端添加酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。 設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對(duì)，應(yīng)盡量避免在引物3’端的第一位堿基是A。（容易錯(cuò)配）引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因?yàn)樗麄冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。 酶切位點(diǎn)都需要保護(hù)堿基以利于內(nèi)切酶的有效切割。酶切位點(diǎn)前加保護(hù)堿基 1，兩個(gè)酶切點(diǎn)至少隔上3個(gè)堿基，在做載體構(gòu)建的時(shí)候設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增片段進(jìn)行定向連接，除了酶切位點(diǎn)，還要在兩端加一個(gè)三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列，否則PCR產(chǎn)物很難被酶切，因此就會(huì)導(dǎo)致連接失敗，因?yàn)閮?nèi)切酶需要一定的輔助性堿基才能順利切割，在沒有輔助堿基的情況下，有的酶是可以切割的，比如：SalI和SpeI，他們不需要輔助性堿基即可切割，但大部分酶是需要輔助性堿基的。所以引物順序應(yīng)是：5’—保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+引物配對(duì)區(qū)—3’ 下面是幾個(gè)戰(zhàn)友的討論，請(qǐng)問：在引物的5‘端加限制酶切位點(diǎn)，只在酶切位點(diǎn)的5‘端加保護(hù)堿基可以嗎？還是必須要在酶切位點(diǎn)的兩側(cè)加保護(hù)堿基？ 是的，只要在5‘端加保護(hù)堿基可以了。其實(shí)保護(hù)堿基就是要給限制性內(nèi)切酶一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，3‘端還有更長的引物序列在，當(dāng)然不需要再加保護(hù)堿基了， 下面就來討論一下這個(gè)問題：（下面引自NEB網(wǎng)站） 1、寡核苷酸近末端位點(diǎn)的酶切為了解不同內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（這里用的是寡核苷酸！！而不是末端帶酶切位點(diǎn)的肽鏈?。?shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于確定雙酶切順序?qū)?huì)有幫助（比如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí)），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近DNA末端時(shí)也很有用。然后NEB就提供了一個(gè)表，關(guān)于鏈長和切割效率的。我覺得這只能說明酶在作用于識(shí)別位點(diǎn)時(shí)所需占據(jù)的鏈長，并不能說明在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)要加那么長的保護(hù)堿基，比如我用的NotI，要加10個(gè)堿基，切25個(gè)小時(shí)才95％的效率，這還是用了20倍的酶量！我?guī)熃阒患恿?個(gè)堿基，也沒見出現(xiàn)問題。 2、線性載體近末端位點(diǎn)的酶切將線性載體與相應(yīng)內(nèi)切酶（10 units/μg）在適宜溫度及緩沖液條件下反應(yīng)60分鐘，隨后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。切割效率=100%-(酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子數(shù)/再連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子數(shù))""近末端堿基對(duì)數(shù)"指的是從識(shí)別位點(diǎn)到DNA末端的堿基對(duì)數(shù)，但并不包括最初切割位點(diǎn)處留下的單鏈突出堿基。（解釋一下：就像下面這個(gè)例子EcoRI酶切位點(diǎn) NNNG AATTC NNC TTAAG 它的近末端堿基對(duì)數(shù)就是3，而不是4）還沒有證據(jù)表明單鏈核苷酸能否提高切割效率，因此在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)應(yīng)至少加上4個(gè)額外堿基。 Not I 7 100 (2) Bluescript SK- Spe I 4 100 (1) Bluescript SK-Ksp I 1 98 (2) Bluescript SK Xba 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