凝血因子檢測

1． 參與凝血過程的凝血因子有哪些？

凝血因子（coagulable factor）也稱凝血蛋白（coagulable protein）,迄今已證實有14個因子參與凝血過程，包括國際凝血因子命名委員會規(guī)定以羅馬數(shù)字命名的凝血因子11個（凝血因子I~XIII，其中凝血因子IV是鈣離子，凝血因子VI因被證實是因子V的活化形式而廢除）以及激肽生成系統(tǒng)中的前激肽釋放酶和高分子量激肽原。

2． 凝血過程包括哪幾條途徑？

凝血是一系列血漿凝血因子相繼酶解激活的過程，最終結果是生成凝血酶，形成纖維蛋白凝塊。凝血過程一般被分為內源性凝血途徑和外源性凝血途徑（其中包括凝血的共同途徑），兩條凝血途徑的主要區(qū)別在于啟動方式及參加的凝血因子不同，結果形成兩條不同的因子X激活通路。

（1） 內源性凝血途徑是指參與的凝血因子全部來自血液（內源性），這一凝血途徑通常是因血液與帶負電荷的異物表面（如玻璃、白陶土、膠原等）接觸而啟動（接觸激活）；（2） 外源性凝血途徑是指參與凝血的因子不完全來自正常血液中，部分由組織中進入血液。這主要是指組織因子由各種途徑（血管損傷、血液中細胞的釋放表達等）進入血液，引起因子VII的活化，并與之構成復合物，進而激活因子X、因子II，最終形成纖維蛋白。（3） 共同途徑，在內源和外源凝血途徑中，因子X被因子IXa、VIIIa或因子VIIa-TF所激活，之后的凝血酶生成、纖維蛋白單體在因子XIIIa和Ca² 作用下形成纖維蛋白過程是完全相同的。

3．內源性和外源性兩條凝血途徑的凝血方式有何不同？

內源性和外源性凝血途徑的主要不同在于：①啟動方式不同，內源性凝血途徑啟動于接觸活化，即由因子XII接觸帶負電荷的物質被激活開始，外源性凝血途徑由受損的血管壁釋出組織因子啟動；②激活因子X的復合物不同，內源性凝血途徑由因子IXa,VIIIa,Ca離子形成的復合物激活因子X。外源性凝血途徑由因子IIIa,VIIa，Ca離子形成的復合物激活因子X；③參與因子及所需時間不同，內源性凝血途徑參與的凝血因子多，反應步驟復雜，需要3~8分鐘，外源性凝血途徑參與的因子少，反應步驟簡單，所需時間不到10秒。

實驗性問題

1． 凝血酶原時間（PT）測定幾種報告方式有何不同？PT結果的報告方式包括①秒數(shù)、②PT比值：即病人PT測定秒數(shù)除以正常平均PT數(shù)的比值、③活動度：在以不同稀釋度的血漿制成的PT標準曲線上按病人秒數(shù)讀取相應的活動度、④國際正?；戎?/span>INR，共四種方式。

2．INR系統(tǒng)是怎樣一個概念？INR系統(tǒng)主要應用于口服抗凝劑患者的用藥監(jiān)測上。因為不同的PT試劑組織凝血活酶的來源不同所以試劑敏感性不同導致測定同一標本PT結果的沒有可比性，前面三種報告方式均無法解決這一問題，INR的報告方式則解決了這一問題。INR=PTR^ISI，其中的ISI值是指PT試劑的國際敏感度指數(shù)，理論上任意試劑測同一標本的PT所得的INR值理論上是相等的，這樣就建立了PT結果的可比性。使用INR應注意幾點：①ISI值越高，INR變異越大，所以口服抗凝劑監(jiān)測時應盡可能選用ISI值接近1.0的試劑，以獲得較好的精確性；②INR的局限性——不適用于以下情形：口服抗凝劑初期的病人血漿，肝病凝血因子缺陷病人血漿，非抗凝治療而PT延長的病人血漿。

3．進行PT測定的同時如何演算纖維蛋白原濃度值？PT測定完后纖維蛋白原會轉變成纖維蛋白，其形成的濁度與纖維蛋白原的含量成正比，因此不需任何試劑，即可由產生的濁度直接推算出纖維蛋白原的含量。但演算法的應用必須注意一個前提：當血漿的Fbg 含量在正常范圍時，該法與經典的Clauss法無顯著差異，但Fbg含量超出正常范圍時，它的結果與Clauss法相差太大，所以演算法只能作為篩選試驗，如果Fbg含量超出正常仍然需要更準確的Clauss定量法。

 4．常用的凝血篩選試驗有哪些？（1） 凝血酶原時間（PT），外源凝血系統(tǒng)的篩選試驗，反映血漿中凝血因子I、II、V、VII、X水平的試驗，其INR的報告方式用于口服抗凝劑的篩選。（2） 活化部分凝血活酶時間測定（APTT），內源凝血系統(tǒng)的篩選試驗，反映血漿中凝血因子VIII、IX、XI、XII水平的試驗，常用APTT對肝素抗凝治療進行監(jiān)測。（3） 凝血酶時間（TT），TT時間的延長反映肝素或類肝素物質增多，AT-III活性增高，纖維蛋白原的量和質異常。（4） 纖維蛋白原定量（Fbg）,用凝血酶法測定Fbg含量所用試劑與TT相同都是凝血酶但濃度要遠遠高于TT，這是為了防止標本中肝素的干擾重點檢測Fbg濃度。臨床上主要用于先天性纖維蛋白原異常，彌漫性血管內凝血和嚴重肝臟疾病，以觀察纖維蛋白原減少的程度。在糖尿病、心腦血管病、燒傷、手術后和某些急性傳染病，血漿纖維蛋白原可能增高，血液凝固性有增強的傾向。

 臨床性問題

1． 凝血酶原片段1 2（F_{1 2}）測定的臨床意義？血漿因子Xa可使因子II分子中的Arg(273)-Tyr(274)及Arg(322)-Ile(323)間肽鍵同時被裂解，以N端釋放出片段F_{1 2}，即Ala(1)-Arg(273);然后激活生成的凝血酶再反饋裂解酶原本身，釋放出片段1（F1）即Ala(1)-Arg(155)及片段2（F2）即Ser(156)-Arg(273),由此可見F1 2是反映凝血酶原酶的活性，是因子II的分子標志物，在深靜脈血栓形成、肺栓塞、彌散性血管內凝血、遺傳性蛋白C缺乏癥時F1 2升高，而在口服抗凝劑患者F1 2減低，可作為口服抗凝劑的監(jiān)測指標之一。

2． 證實凝固亢進狀態(tài)和血栓傾向的早期指標有哪些？（1） 凝血酶原片段1 2（F1 2）：直接反映凝血酶的生成全量，反映凝血酶生成的最敏銳指標；（2） 凝血酶抗凝血酶復合物（TAT）：TAT復合物的形成是凝血酶已生成的分子標志物；（3） 纖維蛋白肽A（FPA）：凝血酶作用于纖維蛋白原的早期產物，反映凝血酶生成的敏感指標；

3． 在診斷血友病過程中，要排除與血友病相關聯(lián)的其它凝血因子缺乏癥，考慮做哪些試驗以鑒別診斷？（1） 出血時間及vWF:Ag測定，出血時間延長和vWF:Ag減低有助于診斷VWD型；（2） 凝血酶原時間測定和蝰蛇毒時間測定，兩者均延長有助于排除因子X缺乏；（3） 復鈣交叉試驗和因子VIII抗體測定，有助于排除獲得性因子VIII缺乏。

4． 診斷肝病時，對病情和判斷預后有價值的止凝血指標有哪些？推薦的指標有：①因子VII：C和II：C減低，先于肝功能異常，可作為肝病早期診斷的指標之一。②Fg和因子V：C減低，反映肝病嚴重，或進入肝硬化。③異常凝血酶原增高是診斷原發(fā)性肝癌的參考指標之一。④因子VIII：C和vWF:Ag水平越高，反映肝病越嚴重，因子VIII：C降低提示并發(fā)DIC。⑤因子XIIa:Ag、ATIII的水平低于35%或Plg的水平低于20%提示預后不良。肝病時常呈多個因子的聯(lián)合變化，故需要綜合分析。

抗凝因子檢測

理論性問題

1．血液中主要生理性抗凝因子有哪些？血液中的抗凝因子主要有三個體系：抗凝血酶(antithrombin, AT)、蛋白C系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物。1）抗凝血酶(antithrombin, AT)是主要的生理性血漿抗凝物質，尤其對凝血酶的滅活能力占所有抗凝蛋白的70~80%。AT的抑酶譜很廣，除凝血酶外，它還能抑制凝血因子Xa、IXa、XIa、XIIa以及纖溶酶、胰蛋白酶、激肽釋放酶等。肝素作用于AT的賴氨酸殘基可以大大增強AT的抗凝血酶活性（2000倍以上）（2）蛋白C系統(tǒng)除蛋白C（protein C, PC）外，還包括蛋白S（protein S, PS）、血栓調節(jié)蛋白（thrombomodulin, TM）和內皮細胞蛋白C受體（endothelial protein C receptor, EPCR）.（3）組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor, TFPI）調節(jié)TF-VIIa參與的凝血作用.TFPI可以直接抑制活化的X(Xa),并以依賴Xa的形式在Ca² 存在條件下抑制TF/VIIa復合物。

 2．病理性的抗凝物質有哪些？（1） 類肝素抗凝物：多種疾病可產生此類物質，它具有抑制因子V、VIII、X和凝血酶活性的作用。（2） 狼瘡性抗凝物質：該類物質是一種與血栓形成、血小板減少和周期性流產相關的免疫球蛋白，是在某些病理情況下產生，此種物質屬于IgG或IgM,可抑制因子XIIa和IXa。抑制基于磷脂的凝血試驗，包括PT和APTT。（3） 凝血因子抑制物：常見于血友病甲患者，長期接受因子VIII制劑治療后，產生因子VIII的抗體。

3．活化蛋白C（APC）的生理功能？激活的蛋白C（PC）稱活化蛋白C（APC），具有明顯抗凝血栓作用。在凝血過程中產生的凝血酶可與未受損血管內皮細胞上受體之一血栓調節(jié)蛋白（thrombomodulin, TM）結合，從而激活PC，這一作用是未結合TM凝血酶激活PC的20000倍。

實驗性問題

1．抗凝系統(tǒng)的成分在血凝儀中主要采取哪種檢測方法？自動血凝儀對抗凝和纖溶成分的檢測以發(fā)色底物法為主，其原理是通過人工合成與天然凝血因子相似的一段氨基酸排列順序并含有特定作用位點的小肽，并將可水解產色的化學基團與作用位點的氨基酸相連。測定時由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不僅作用于天然蛋白質肽鏈，也能作用于人工合成的肽段底物，從而釋放出產色基團，使溶液呈色。產生顏色的深淺與凝血因子活性成比例關系，故可進行精確的定量。目前人工合成的多肽底物有幾十種，最常用的是對硝基苯胺，呈黃色，可用405nm波長進行測定。

2．口服抗凝治療藥物主要監(jiān)測方法？PT實驗是最常用的監(jiān)測方法，用于監(jiān)測由口服抗凝藥物（華法令等）引起的維生素K依賴性因子II、VII和X的功能性水平變化。

3．靜脈肝素抗凝治療監(jiān)測方法？小劑量皮下肝素（小于12500U/d）不能可靠地產生抗Xa因子活性，無需監(jiān)測，皮下應用超過12500U/d或靜脈用藥必須監(jiān)測，肝素皮下應用時APTT測定采血時間應在注射后4~6h。調整APTT為正常對照的1.5~2.5倍為宜，不應超過100秒。APTT測定的敏感范圍為0.1~1.0U/ml，適用于深靜脈血栓形成、不穩(wěn)定心絞痛和急性心肌梗塞溶栓后靜脈肝素的監(jiān)測，此時要求目標肝素濃度約為0.3~0.7U/ml。

4． 使用肝素抗凝治療時為何要監(jiān)測ATIII的量？肝素是ATIII的輔助因子，兩者結合后，ATIII的生物效應，即滅活凝血酶的速率可提高1000~2000倍，但最終抑制絲氨酸蛋白酶的效應還是取決ATIII的量。當ATIII的活性為70%時，肝素的作用約降低65%；當ATIII的活性為50%時，肝素的作用只有原來的1/5。說明當體內ATIII活性明顯降低時，單純應用肝素治療，其療效受到明顯影響，所以當檢測發(fā)現(xiàn)ATIII活性低于50%，肝素效應不與預見相一致時，要考慮補充ATIII。

 臨床性問題

1． ATIII測定的臨床意義？i. 遺傳性ATIII缺乏可分為兩型：①CRM^-型，即抗原與活性均下降。②CRM 型，抗原正常，活性下降。ii. 獲得性ATIII缺乏：①ATIII合成降低，見于肝臟疾病、肝功能障礙，主要見于肝硬化、重癥肝炎、肝癌晚期，常與疾病嚴重度相關，可伴發(fā)血栓形成。②ATIII丟失增加，見于腎病綜合癥等。③ATIII消耗增加，見于血栓前期和血栓性疾病。iii. ATIII水平增高：在血友病A和血友病B、口服抗凝藥物、使用黃體酮類藥物時有報道ATIII水平增高。

2．什么是活化蛋白C抵抗性（APC resistance，APCR）現(xiàn)象？在正常情況下，血漿中如果加入APC，由于APC裂解FVa和FVIIIa, 活化的部分凝血活酶時間（APTT）應延長。如果對APC抗凝反應低下，稱為APCR現(xiàn)象。發(fā)生的基礎是FV基因的單個位點突變（核苷酸序列第1691位G→A）導致FV分子氨基酸序列第506位Arg(R) →Gln(Q)(FV R506Q)。該突變亦稱FV Leiden突變。突變的FVa雖然保持著促凝活性，但對APC的裂解作用的敏感性大大降低。凝血酶形成速度加快，又反饋性激活FV、FVIII。凝血途徑活化加速，伴降解FVIIIa的APC輔因子活性降低，APCR作用增強，導致高凝狀態(tài)形成。

纖溶活性檢測

1．何謂纖溶系統(tǒng)，主要包括哪些成份？纖維蛋白溶解系統(tǒng)（fibrinolytic system）簡稱纖溶系統(tǒng)，是指纖溶酶原經特異性激活物使其轉化為纖溶酶(plasmin,PL)，以及PL降解纖維蛋白和其他蛋白的過程。纖溶過程是一系列蛋白酶催化的連鎖反應，是正常人體的重要生理功能，它與血液凝固存在著既矛盾又統(tǒng)一的動態(tài)平衡關系，其主要作用是將沉積在血管內外的纖維蛋白溶解而保持血管通暢，防止血栓形成或使已形成血栓溶解，血流復通。纖溶系統(tǒng)主要有纖溶酶原、纖溶酶原激活物、纖溶酶及纖溶抑制物等蛋白酶組成。

實驗性問題

1． 原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶的實驗室指標有何不同？原發(fā)性纖溶：纖維蛋白肽A（FPA），D-二聚體以及血涂片上破碎和異形紅細胞的發(fā)生率正常，FDP增高但D二聚體正常此是與繼發(fā)性纖溶的重要鑒別點。繼發(fā)性纖溶主要見于彌散性血管內凝血，FDP和D二聚體都會增高。

 臨床性問題

1．原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶的發(fā)病機制有何不同？兩者的發(fā)病機制有所不同，原發(fā)性纖溶是由于循環(huán)血管內皮細胞及（或）組織中血管內皮細胞受損，大量t-PA及（或）u-PA釋放，水解纖溶酶原，使其轉化成纖溶酶，后者使纖維蛋白原降解。繼發(fā)性纖溶是通過內激活途徑，也就是說先有致病因子激活因子XII，因子XII轉變?yōu)橐蜃?/span>XIIa和XIIf，因子XIIf可激活激肽釋放酶原，使后者轉化為激肽釋放酶（KK），XIIa、XIIf和激肽釋放酶（KK）都可以水解纖溶酶原，使其轉化成纖溶酶，使纖維蛋白原和纖維蛋白降解。繼發(fā)性纖溶最常見于彌散性血管內凝血。

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