摘要

長非編碼RNA通過和蛋白質(zhì)互作行使功能（可能是一對多或者多對一的互作關系）。當前的知識已經(jīng)描繪出一個復雜的互作網(wǎng)絡，它的失調(diào)會導致疾病的產(chǎn)生。在最近幾年一些技術開發(fā)出來基于高通量得到蛋白質(zhì)和RNA的綁定關系。同時，有關于RBP(RNA綁定蛋白)和lncRNA的精確的互作生物信息學方法開發(fā)了出來。這個領域發(fā)展越來越快，可以預見的是在不久的將來，蛋白質(zhì)lncRNA互作的網(wǎng)絡會變得越來越大，為探究lncRNA的細胞機制和疾病發(fā)生提供線索。

背景

越來越多的有關于RNA綁定蛋白（RBP）靶點的知識使得研究焦點轉(zhuǎn)移到了非編碼RNA，不僅僅有發(fā)揮翻譯調(diào)控功能的RNA(rRNAs，tRNAs，小干擾RNA和miRNA)，還有大量的異質(zhì)性很強的長的非編碼RNA.

有關于lncRNA，只有非常小的一部分被很好的刻畫了。但是他們通過各種各樣的分子機制參與到非常廣泛的生物學過程中。

有關于蛋白質(zhì)和RNA的互作，許多的互作中的蛋白質(zhì)或者RNA和疾病狀態(tài)相關，其中就涉及到了很多的lncRNA。

有關于lncRNA功能信息的缺失，進一步有關于和行使功能的lncRNA具體特異的序列的缺失，阻止了我們對lncRNA和細胞過程聯(lián)系的認知。

從另一個方面來看，有許多的實驗的和計算的方法用來識別RNA和蛋白質(zhì)互作，其實這些方法也可以識別lncRNA和蛋白質(zhì)的互作，最近出來了越來越多的lncRNA和蛋白質(zhì)互作的數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)和lncRNA互作的檢測

最近很多年，有關于這個方面的檢測方法很多。首先出現(xiàn)的是低通量的檢測方法，只能檢測一個或者幾個RNA的互作（包括the RNA electrophoretic mobility shift assay, RNA pulldown assay, oligonucleotide-targeted RNase H protection assay and FISH co-localization）。

后來才出現(xiàn)蛋白組（轉(zhuǎn)錄組）范圍的高通量的方法，這類方法根據(jù)以誰為中心進行研究以及是否是體內(nèi)分成了下面的幾類，如下表：

以蛋白質(zhì)為中心的體外檢測方法

流程圖如下

這類方法旨在找出和感興趣蛋白互作的RNA片段（這些片段是人工合成的，并不是真實生物體中的RNA片段）。包括下面幾個方法：

SELEX；SEQRS and RAPID-SELEX，HTSELEX（SELEX的變形，在篩選標準上放松了一些，可以得到比SELEX更多的互作關系對）；RNAcompete（旨在尋找蛋白質(zhì)的短序列的RNA互作片段）；RNA Bind-nSeq (RBNS)（旨在尋找蛋白質(zhì)長序列的互作片段，并且有自己獨特的篩選標準）；RNA-MaP。

這類方法找到的蛋白質(zhì)綁定的RNA不是真實的RNA轉(zhuǎn)錄本，所以，需要尋找到這些RNA對應的mitif，然后對應到真實的RNA上。（尋找RNAmotif的算法有MEME 和GLAM2和MEMERIS和Aptamotif等等）

這類方法的限制：1，是在人工合成（隨機生成的RNA庫）中檢測的，檢測出來的結(jié)果不真實，這個可以使用真實的轉(zhuǎn)錄組的樣本進行彌補 2，蛋白質(zhì)和RNA互作的環(huán)境是在體外，并不是在生物體內(nèi)，眾所周知環(huán)境對互作影響很大，不可信         盡管有上面的限制，通過體外的實驗檢測出來的一些互作和一些體內(nèi)實驗檢測出來的結(jié)果很是接近，說明它還是有一定的可信度的。

到目前為止，體外檢測蛋白質(zhì)和RNA互作的的方法應用并不廣泛，因為體內(nèi)檢測的方法發(fā)展的很好（更加的可信）。

有一些數(shù)據(jù)庫存儲著體外檢測的RNA和蛋白質(zhì)互作：RBPDB存儲著lncRNA和蛋白質(zhì)的互作。

以蛋白質(zhì)為中心的體內(nèi)檢測方法

這類方法的基礎是使用一個抗體把RNA綁定蛋白抗下來。

流程圖：

流程：在真實的轉(zhuǎn)錄組的環(huán)境中，先讓蛋白質(zhì)（紅色）和RNA互作，然后使用抗體（藍色）把蛋白質(zhì)抗出來，順帶著帶出來了和蛋白質(zhì)互作的RNA片段，然后對帶出來的RNA片段進行測序就可以了。

這類方法中包括RIP-Chip  RIP-seq  CLIP  HITS-CLIP   PAR-CLIP    Iclip  CRAC等等。

其中RIP-Chip  RIP-seq只能夠識別出和某個蛋白質(zhì)互作的轉(zhuǎn)錄本，但是不能夠識別出這個蛋白質(zhì)具體的是和這個轉(zhuǎn)錄本上的哪個堿基是互作的，也就是不能夠識別出和蛋白質(zhì)互作的具體的RNA位置。

后面的方法CLIP  HITS-CLIP   PAR-CLIP    Iclip可以解決上面方法的不足，可以識別出和蛋白質(zhì)互作的RNA的具體的位置信息（其中CLIP是后面的方法的基礎，后面的方法中其他的方法都是這個方法的變種）。

CRAC方法并不是基于抗體抗蛋白的方法設計的方法。

分析通過高通量測序得到的蛋白質(zhì)RNA互作的原始數(shù)據(jù)需要借鑒二代測序中的一些方法和工具。主要通過下面的幾個流程：a 把測序得到的read匹配到參考基因組(轉(zhuǎn)錄組)上 b 識別出可以代表真實RNA的read簇 c 推測出RNA和蛋白質(zhì)互作的事件。

其中匹配到基因組的時候一定要注意區(qū)分出交聯(lián)產(chǎn)生的突變（在CLIP技術中體現(xiàn)的非常的明顯，如果感興趣可以可以讀一下文章中這塊對應額部分）和測序誤差。

其中b步的結(jié)果還可以通過一些算法做進一步的篩選得到更可信的結(jié)果。這些算法都是通過卡CIMS（交聯(lián)導致的突變，詳細內(nèi)容可以看原文中CLIP部分）的個數(shù)進行篩選。算法包括：PARalyzer, Piranha, wavClusteR, RIPSeeker, MiClip, PIPE-CLIP and the Pyicoclip。這些算法大體上分為兩步：1，識別出和蛋白質(zhì)互作的RNA簇 2，對這些簇進行排秩。

已知的基因 轉(zhuǎn)錄本 外顯子的基因組坐標可以把識別出來的簇映射到轉(zhuǎn)錄本。通常很多數(shù)據(jù)庫都是針對基因構建的，有關于lncRNA的信息并不多，所以需要去專門針對于lncRNA開發(fā)的數(shù)據(jù)庫中尋找lncRNA的相關信息，例如：GENCODE的lncRNA目錄 NONCODE  LNCipedia等等。

其中第c步的結(jié)果到目前為止，還沒有好的方法可以得到高魯棒性的結(jié)果，因為RNA和蛋白質(zhì)的互作的機制復雜性和異質(zhì)性。

以RNA為中心的方法

這類方法是使用純化的RNA提取和它綁定的蛋白質(zhì)，然后使用質(zhì)譜 蛋白質(zhì)芯片和其他的技術來檢測蛋白質(zhì)的類別。

流程圖如下：

使用某個RNA識別出來的和其互作的蛋白組，其實這個蛋白組不僅僅只和這個RNA互作，而是和這個RNA代表的一類RNA互作，比如識別POLYa綁定的蛋白組。

這類方法也有體內(nèi)體外之分。

盡管這些方法的效能很好，這些方法還是有一定的技術上的挑戰(zhàn)性的。比如尤其是在體內(nèi)方法中識別道德蛋白的量很少，不足以做質(zhì)譜分析，因為這個原因，所以很多的文獻中應用到的RNA都是高表達的RNA,這阻礙了它應用到低表達的lncRNA上；基于交聯(lián)的方法可有效的解決這個問題。

生物信息學方法

這么多的實驗的數(shù)據(jù)，為我們的生物信息學方法的開發(fā)提供了豐富的材料，可以從計算學的角度預測出新的互作關系對。之前開發(fā)的方法大部分是針對RNA和蛋白質(zhì)的互作，而LNCrna也是RNA的一種，所以這些方法同樣適用于lncRNA。而且針對lncRNA的計算學方法的開發(fā)尤其重要，因為有關于它的實驗數(shù)據(jù)很少。

這類方法包括RPIseq  catRAPID  lncPro  RPI-Pred  PRIPU等等。

有關于計算學方法的一個焦點是 方法中使用了案例的某些性質(zhì)，而在檢驗集合中找不到。

有鑒于此，我覺得一個好的普遍適用的方法最好使用一些非常基礎的大家有性質(zhì)進行預測，那么這個方法的效能會很好。