染色質免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一種用于研究目的蛋白在染色質上定位的技術。ChIP 的原理是通過甲醛處理細胞固定 DNA 和蛋白，然后提取染色質，使用超聲或酶解將染色質剪切成小片段。

之后使用結合在染色質的目的蛋白或組蛋白修飾特異性抗體富集 DNA 片段。富集的 DNA 片段可以通過 PCR，DNA 芯片或測序進行分析。雖然原理看起來很簡單，但 ChIP 是一項非常具有挑戰(zhàn)的技術，很多因素都可能導致實驗失敗。

如何選擇 ChIP 抗體？

抗體的質量是 ChIP 成功非常關鍵的因素，只有能夠識別染色質狀態(tài)下的天然蛋白構象的高質量的抗體才能用于 ChIP 實驗。

想要知道一個抗體是否適合用于 ChIP 實驗其實很簡單。正規(guī)廠家的說明書都會有一項是說明應用范圍的。挑選抗體時優(yōu)先選擇應用范圍有「ChIP」并有相關數(shù)據的，說明抗體經過檢測，可以用于 ChIP。如果找不到這樣的抗體可以優(yōu)先挑選經過 IF、IP、ICC 驗證的，之后自己進行驗證或委托外包服務公司進行驗證。

除此之外，在做組蛋白修飾 ChIP 時，因為各種組蛋白修飾之間差異非常小，這對抗體特異性提出了更高的要求。如果抗體特異性不夠高導致發(fā)生交叉反應，很可能產生假陽性或假陰性結果。針對這一問題，可以使用包括 384 種不同修飾的組蛋白芯片檢測自己生產組蛋白抗體特異性，保證組蛋白抗體的高特異性。 

沒有特異性抗體怎么辦？

如果目標蛋白沒有商業(yè)化的抗體可選，一種方式是定制抗體，之后進行 ChIP 驗證。這種方式的優(yōu)點是檢測到的是內源性的蛋白，結果反映的一定是體內真實的蛋白和 DNA 相互作用。但定制抗體成本較高，并且 ChIP 驗證過程失敗率高達 75%。

另一種方式是給目標蛋白加標簽，通過標簽檢測目標蛋白。AM-Tag 標簽是專門針對 ChIP 設計的蛋白標簽。通過質粒構建加到目標蛋白 C 端。轉染進入細胞之后通過特異性 AM-tag 抗體進行 ChIP。Active Motif 實驗室通過構建雌激素受體（ER）加 AM-tag 標簽質粒檢測 AM-tag ChIP 效果，結果數(shù)據與發(fā)表文章中使用 ER 抗體檢測內源性蛋白結果一致。

沒有足夠的起始樣本怎么辦？

ChIP 是一項富集技術，不是純化方法。大部分我們感興趣的蛋白或組蛋白修飾分布在整個基因組，只是不同區(qū)域的富集度不同。因此，有意義的結果需要高效的富集。

傳統(tǒng)的 ChIP 實驗需要至少兩百萬細胞作為起始材料，這對于有些珍貴細胞樣本是非常困難的。解決這個問題的關鍵是通過 ChIP 的 buffer 及條件優(yōu)化，降低非特異性的背景，實現(xiàn)最優(yōu)的信噪比。

針對這個問題，一方面通過 buffer 條件優(yōu)化，提供高靈敏 ChIP 試劑盒，最少可用 1000 個細胞進行 ChIP 實驗。另一方面，也提供低細胞量的 ChIP-Seq 服務，對于高豐度目標蛋白（如組蛋白修飾）僅需 10000 個細胞；對于低豐度目標蛋白（如轉錄因子），僅需 50000～500000 個細胞。

如何對 ChIP-seq 進行精確定量？

我們的研究團隊在對不同樣本的 H3K27me3 ChIP-seq 數(shù)據比較時，發(fā)現(xiàn)了一個有意思的問題。通過 H3K27me3 甲基轉移酶 EZH2 的抑制劑處理細胞以后，免疫印跡檢測結果表明，H3K27me3 整體水平顯著下降。ChIP-qPCR 也檢測到很多位點的 H3K27me3 水平有明顯下調。

但用常規(guī)的 ChIP-seq 分析方法比較，并不能檢測到 H3K27me3 水平的下降。造成這個結果的原因在于在標準的 ChIP-seq 實驗過程中，文庫構建需要的 PCR 擴增以及常規(guī)數(shù)據分析時對整體數(shù)據量的校正掩蓋了樣本間數(shù)據量的差異。

針對這一問題，Active Motif  憑借多年的 ChIP-seq 服務經驗成功研發(fā)出「Spike-In」校正策略。標準的 ChIP 反應是使用樣本染色質和抗體建立的。在「Spike-in」校正體系中，果蠅（Dropsophila）「Spike-in」染色質和識別果蠅染色質的抗體也被加入到反應體系中。因為果蠅的基因組和人的基因組同源性很低，在做測序分析的時候，它就可以作為內參，對整個 ChIP-seq 起到矯正作用。

RIME（Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins）是一項 ChIP 和質譜分析相結合的技術。非常適合用于鑒定轉錄輔助因子和染色質相關蛋白的相互作用。傳統(tǒng)的鑒定蛋白相互作用的方法是 IP 之后進行質譜分析。與 IP 方法不同，RIME 使用的起始材料經過交聯(lián)，主要檢測的是染色質上蛋白之間的相互作用。

怎么檢測同一基因組位置的兩個蛋白質或不同的組蛋白修飾？

當進行 ChIP 實驗去解碼組蛋白編碼時，證明兩個不同的蛋白質或者組蛋白修飾占據同一個核小體位點是非常有意義的?；蛘?，您也許需要確定一個蛋白質和特定的組蛋白修飾是否在同一個調控元件。

Sequential ChIP（也叫做 Re-ChIP）是一項使用兩個不同抗體進行連續(xù) ChIP 反應的技術，第一次 ChIP 反應之后使用特殊 buffer 洗脫沉淀的染色質以避免第一個抗體對后續(xù) ChIP 的影響。之后加入第二個不同的抗體進行 ChIP。通過兩個不同抗體和兩次 ChIP 反應，得到兩個蛋白或不同組蛋白修飾所在的同一基因組 DNA 片段。

有證據顯示 RNA 導向過程在介導染色質結構和表觀遺傳記憶有重要作用。從染色質中純化的核酸含有 2～5% RNA；這些 RNA 是非編碼的序列，在染色質結構和轉錄沉默中有重要作用。

然而，因為染色質的復雜度以及染色質中大量 DNA 的存在，用傳統(tǒng)的 ChIP 技術研究這些 RNA 是很困難的。為了使基因組調控中 RNA 的功能研究變得可能，我們利用其在 ChIP 的技術研發(fā)了 RNA-ChIP 的第一代試劑盒，主要用于研究染色質中 RNA-蛋白質的相互作用。

RNA-蛋白質的相互作用用甲醛固定，染色質剪切結合 DNA 酶處理得到了可以用特異性蛋白抗體免疫沉淀的 RNA/蛋白質復合物。隨后進行解交聯(lián)，解交聯(lián)之后的 RNA 再用 DNA 酶處理確保沒有 DNA 污染。