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蛋白定量DIA產(chǎn)品，主要采用數(shù)據(jù)非依賴性采集模式（data independent acquisition，DIA），通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）對蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)合傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)依賴性采集模式（datadependent acquisition，DDA）構(gòu)建的譜圖庫，利用業(yè)內(nèi)頂尖的商業(yè)化DIA分析軟件Spectronaut，可對蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒定、定量，獲得肽段、蛋白及所屬物種來源、蛋白表達(dá)量變化等信息。 產(chǎn)品優(yōu)勢 蛋白定量DIA技術(shù)，采用全景式數(shù)據(jù)采集模式，效果對比下：
圖1 HRM（DIA）vs Shotgun proteomics（DDA） 圖中橫坐標(biāo)是分組的樣本編號，縱坐標(biāo)是蛋白質(zhì)種類，該圖展示的是各樣本中，不同質(zhì)譜采集模式下，蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度情況。其中DIA比DDA的峰強(qiáng)度覆蓋度更好，偏向性較??；DDA缺失值較多，并且對高豐度肽段有偏向性。
產(chǎn)品應(yīng)用
技術(shù)路線
信息分析內(nèi)容
1、11家實(shí)驗(yàn)室SWATH*技術(shù)平行性評測Multi-laboratory assessment of reproducibility,qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature communications. 2017. *注：SWATH技術(shù)與DIA技術(shù)原理相同，同為二級譜采集荷質(zhì)比范圍內(nèi)全部母離子的碎片離子信息，但不同儀器公司開發(fā)此技術(shù)時(shí)使用的名稱有別，故可以理解為同一種技術(shù)。 背景：實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)是科學(xué)研究最基礎(chǔ)的原則。本文評估了全球11家實(shí)驗(yàn)室共同鑒定和定量到的蛋白數(shù)據(jù)集，其重現(xiàn)性、線性動態(tài)范圍和靈敏度都非常接近于SRM——蛋白定量金標(biāo)準(zhǔn)。這份數(shù)據(jù)支持SWATH聯(lián)合肽段標(biāo)準(zhǔn)打分的分析方法，適合于大范圍實(shí)驗(yàn)室間全面、重現(xiàn)性好的蛋白組研究。 方法思路：
圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 30個(gè)穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段（SIS）分成5組（group A-E），每組6種肽段，每組樣本中肽段的稀釋濃度從1fmol到10pmol（綠色標(biāo)記S5），然后將每組肽段稀釋4次后混入HEK293樣本中（S1-4），獲得一系列稀釋濃度從0.012到10000fmol。將樣本分成相同的11份分發(fā)給全球范圍內(nèi)的11個(gè)實(shí)驗(yàn)室，評估1天、1周內(nèi)不同地點(diǎn)的數(shù)據(jù)采集情況。
主要結(jié)論： 1）蛋白鑒定情況 在全球11個(gè)實(shí)驗(yàn)室采集的229份SWATH-MS數(shù)據(jù)中，過濾條件為蛋白水平FDR 1%，共檢測到4984種蛋白，4077種蛋白在超過80%的樣本中被檢測到。
圖2 蛋白鑒定的數(shù)目和一致性 每種顏色代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的所有數(shù)據(jù)，11個(gè)實(shí)驗(yàn)室所有數(shù)據(jù)集的重復(fù)性中位數(shù)是91.6%（蛋白水平）和79.5%（肽段水平） 2）定量重現(xiàn)性 經(jīng)過肽段水平的中位數(shù)均一化后，利用4077種在超過80%樣本中檢測到的蛋白去計(jì)算同一天內(nèi)、不同天內(nèi)、不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)采集之間的變異系數(shù)，分別是8.3 ± 16.2%, 11.9 ±17.2%, and 22.0 ± 17.4%。
圖3 變異系數(shù) 比較單個(gè)實(shí)驗(yàn)室一天內(nèi)、不同天內(nèi)的CV變化，以及不同實(shí)驗(yàn)室間的CV變化 3）線性和動態(tài)范圍 利用樣本中加入的同位素標(biāo)準(zhǔn)肽段，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)室計(jì)算梯度濃度設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)肽定量結(jié)果線性擬合系數(shù)，平均決定系數(shù)（R2）是0.97。去除高濃度肽段信號飽和的點(diǎn)，決定系數(shù)增加到0.99。在樣本之間設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)肽理論倍數(shù)有9和27，實(shí)際檢測到的差異倍數(shù)是7.49和19.6，主要原因也是高濃度的標(biāo)準(zhǔn)肽已經(jīng)導(dǎo)致質(zhì)譜儀信號檢測飽和。 圖4 平均峰面積和蛋白水平動態(tài)范圍統(tǒng)計(jì) 平均峰面積圖各點(diǎn)連接顯示出各實(shí)驗(yàn)室間良好的線性指標(biāo)（圖左），蛋白水平動態(tài)范圍是4.5個(gè)數(shù)量級范圍（圖右） 展望：
2、蛋白定量DIA用于慢性疼痛的研究Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of MouseDorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular& Cellular Proteomics. 2016. 背景：慢性疼痛是一種治療方案有限的復(fù)雜疾病。雖對其發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了多次研究，但各結(jié)果間存在較大不一致性，主要受限于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組shotgun技術(shù)固有的缺陷。發(fā)病機(jī)制依然不清晰。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
圖 5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類型 CFA慢性炎癥性疼痛模型、Veh為其對照；SNI慢性神經(jīng)性疼痛模型、Sham為其對照 主要發(fā)現(xiàn)： 1）DDA建庫鑒定到3067個(gè)蛋白，迄今鑒定數(shù)最多的背根神經(jīng)節(jié)蛋白研究。 2）DIA四組都鑒定到的蛋白有2526個(gè)，其中CFA和Vehicle都鑒定到的有2581個(gè)；SNI和Sham都鑒定到的2600個(gè)，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。 3）炎癥性和神經(jīng)性疼痛差異蛋白分別為64和77，兩種模式共有差異蛋白為12個(gè)。 4）其中Serca蛋白在兩種模式小鼠中表達(dá)量變化相反，表明兩種疼痛的調(diào)控機(jī)制不同。 5）western blot和免疫組化對上述DIA結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。
圖6 四組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牡鞍拙垲惙治?/b>
1、蛋白鑒定和定量概況 表1 各樣本鑒定結(jié)果概覽
表2差異蛋白統(tǒng)計(jì)列表
圖1差異蛋白統(tǒng)計(jì)圖 以Fold change≥2和Q-Value＜0.05兩個(gè)條件作為顯著性差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到組間上下調(diào)蛋白統(tǒng)計(jì)（左圖）及火山圖（右圖）
2、質(zhì)控 圖2CV分布及主成分分析 根據(jù)組內(nèi)變異系數(shù)（CV，左圖）評估實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性；通過主成分分析（PCA，右圖），將同一實(shí)驗(yàn)組不同樣本間聚合成簇。
3、功能分析 圖3多樣本關(guān)聯(lián)分析結(jié)果展示 左圖，樣本相關(guān)性分析熱圖；右圖，時(shí)間序列分析 圖4顯著富集的pathway統(tǒng)計(jì)圖 圖中x軸富集因子為注釋到該P(yáng)athway的差異蛋白數(shù)除以注釋到該P(yáng)athway的所有鑒定到的蛋白
表1 組織類樣品送樣要求
表2 蛋白類樣品送樣要求
Q1：怎樣選擇標(biāo)記定量或非標(biāo)記定量？ 標(biāo)記定量一般用于比較背景相似的樣本間的蛋白組差異，若同組比較的樣本數(shù)≤8，推薦選擇iTRAQ標(biāo)記技術(shù)；若同組比較的樣本數(shù)＞8且≤10，推薦選擇IBT標(biāo)記技術(shù)。非標(biāo)記定量技術(shù)的限制情況相對較少，無論樣本間背景是否相似，若同組比較樣本數(shù)＞10，都可推薦選擇非標(biāo)記蛋白定量DIA；若希望蛋白鑒定數(shù)越多越好，或需要鑒定單個(gè)樣本中的特有蛋白，樣本數(shù)＜10，也可推薦使用DIA。 綜上，以下情況可優(yōu)先選擇iTRAQ： 1、定量樣本數(shù)低于8個(gè)（即同時(shí)比較的樣本數(shù)≤8） 2、樣本背景極為相似（相同物種和相同的樣本類型） 3、經(jīng)費(fèi)有限，需要通過高性價(jià)比方案完成研究 4、實(shí)現(xiàn)更好的重復(fù)樣本間的定量重復(fù)性 更適合選擇蛋白DIA定量分析的情況： 1、實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)高于10組 2、不同物種、不同來源或部位的樣本，需要同時(shí)進(jìn)行蛋白組分析和定量 4、追求更精準(zhǔn)的定性定量效果，避免標(biāo)記和液相分組引入的實(shí)驗(yàn)誤差 5、需要對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行多次分析 介于9-10個(gè)樣本的項(xiàng)目，推薦華大IBT 10-plex定量產(chǎn)品。 Q2：蛋白定量DIA和傳統(tǒng)的非標(biāo)記定量有何優(yōu)勢？ 傳統(tǒng)的非標(biāo)記定量一般需要通過分級的方法開展，耗時(shí)久、重復(fù)性差、數(shù)據(jù)結(jié)果可信度不高；蛋白定量DIA技術(shù)是新一代非標(biāo)記定量技術(shù)，可通過更優(yōu)的數(shù)據(jù)采集模式，在相同時(shí)間采集到更豐富的信息，壓縮周期的同時(shí)，大福度提高樣本間平行比較的重復(fù)性，數(shù)據(jù)結(jié)果可信度極高。
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