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自從上次安諾君燃燒洪荒之力為大家介紹了微生物多組學(xué)聯(lián)合分析后，安諾君一直在養(yǎng)精蓄銳，現(xiàn)在洪荒之力稍稍恢復(fù)了些。既然答應(yīng)為大家分享微生物研究的干貨，即使再困難也要做到。這次安諾君就不給大家繞彎子了，直接上干貨~ 首先給大家普及一下什么是全微生物組關(guān)聯(lián)分析，所謂MWAS分析是指捕獲多維尺度上的互作作用，從而提供捕獲復(fù)雜作用關(guān)系的方法，該方法切實可行的預(yù)測微生物組和疾病狀態(tài)的關(guān)系。 小編，麻煩你說人話?。?！噢，額……就是不做任何假設(shè)的分析整個微生物組的結(jié)構(gòu)變化，目的是鑒定與疾病、表型相關(guān)的微生物物種、基因或代謝物質(zhì)等。該分析是挖掘微生物組“寶藏”的有力工具，可以高分辨率的研究微生物組與復(fù)雜疾病的關(guān)聯(lián)特征，比如二型糖尿病、肥胖癥、肝硬化、大腸癌和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。全微生物組關(guān)聯(lián)分析 (MWAS) 與全基因組關(guān)聯(lián)分析 (GWAS) 有些類似，都是把某些復(fù)雜的特征（如物種、基因）與表型特征關(guān)聯(lián)起來。 國內(nèi)最早研究腸道菌群的學(xué)者趙立平教授于2013年首次在Nature Reviews Microbiology期刊上提出了全微生物組關(guān)聯(lián)分析 (Microbiome-wide association studies ,MWAS）的概念[1]，在這篇重量級綜述里，趙老師提出了慢性疾病中腸道菌群致病性的研究策略（如圖1所示），通過時間連續(xù)取樣和多位點取樣的方法，采集指標(biāo)前后宿主表型和微生物樣本等，通過多元分析統(tǒng)計工具等確定可能的致病因素；再采用純培養(yǎng)的方式分離出關(guān)鍵的微生物，利用無菌小鼠模型構(gòu)建疾病模型來驗證。趙老師特意提到所有的研究樣本需在同一時間取樣，特別是糞便樣本、血漿樣本、尿液樣本等。
圖1 慢性疾病中腸道菌群致病性的研究策略 Q 在哪種程度上評估微生物組？ MWAS能夠從物種、基因、功能范疇研究宿主特征與微生物組的關(guān)聯(lián)特征，除此之外還可以在轉(zhuǎn)錄組、蛋白組層面進(jìn)行研究。例如在HMP計劃的數(shù)據(jù)中，個體之間的代謝通路層級的變化程度要小于物種層級的變化。 Q 基于哪些方法來研究微生物組？ 主要基于降維分析工具來實現(xiàn)，包括聚類、PCoA、PCA、一致性分析、因子分析、判別式分析等。在降維過程中通過非監(jiān)督式和監(jiān)督式的方法就能夠發(fā)現(xiàn)一個或多個物種、基因等。 Q MWAS能夠得到什么結(jié)果？ 通常可以得到微生物組（作為一個整體或個體特征的集合體）與表型測量值的關(guān)聯(lián)性，實際案例中，表型之間的差異能夠通過很少的特征來描述。 Q 怎樣建立因果關(guān)系？ 有很多方式能實現(xiàn)，如通過縱向的長時間的研究來確定在疾病表型發(fā)生前微生物或代謝產(chǎn)物發(fā)生變化；臨床實踐證明微生物能夠影響疾病的過程；臨床前期工作：如構(gòu)建小鼠-疾病模型等驗證、建立活性化學(xué)物質(zhì)模型以揭示特異性產(chǎn)生該物質(zhì)的微生物和基因等。 從研究人群選擇（特定患病類型）、樣本取樣（大樣本量）、建庫測序（普通宏基因組文庫）、建立微生物參考基因集、基于宏基因組數(shù)據(jù)的分類、確定與疾病的相關(guān)性、結(jié)果驗證（構(gòu)建動物模型驗證、隨機(jī)雙盲臨床實驗）等[3]（如圖2所示）。 其中關(guān)鍵的步驟是contigs binning，主要假設(shè)是不同樣品中來自同一微生物基因組的基因應(yīng)該具有相同的變化模式，如相對豐度、堿基頻率等，可根據(jù)這一假設(shè)對宏基因組數(shù)據(jù)中注釋的基因進(jìn)行聚類，可以把物種的分辨率提高到菌株水平。目前人們已經(jīng)開發(fā)了不同的相關(guān)系數(shù)和算法，這些聚類方法包括建立MLG (metagenomic linkage groups)[4]、MGC (metagenomic clusters) 或MGS[5] (metagenomic species)[6]。
圖2 通過MWAS發(fā)掘微生物與疾病的關(guān)聯(lián)性的整體方案設(shè)計 目前已有的MWAS分析已經(jīng)非常多了，研究的疾病類型也是多種多樣，具體可以參考2016年王俊等人發(fā)表的綜述文章[2]。 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA) 是一種致殘率較高的自身免疫性疾病，全球患者多達(dá)數(shù)千萬。一直以來人們推測RA可能與細(xì)菌感染有關(guān)，但對可能參與疾病發(fā)生或疾病保護(hù)的細(xì)菌及其功能知之甚少。研究人員還發(fā)現(xiàn)了口腔與腸道菌群功能的一致性。RA患者的口腔與腸道菌群，在氧化還原條件，鐵、硫、鋅和精氨酸的轉(zhuǎn)運和代謝，以及RA相關(guān)抗原如瓜氨酸環(huán)化的分子擬態(tài)等方面均表現(xiàn)出明顯異常，顯示出這種菌群異常在RA的病理生理機(jī)制中有重要作用，有可能直接參與疾病發(fā)生，如圖3所示。 此外，研究人員還基于口腔與腸道微生物菌群元基因組關(guān)聯(lián)分析構(gòu)建了區(qū)分RA患者和健康對照人群的分類診斷模型。綜合三個部位的微生物菌群分類診斷模型，其診斷的準(zhǔn)確率接近100%[7]。
圖3.腸道和口腔樣本中MLGs的關(guān)聯(lián)分析 漲知識了吧，搞科研不易，且行且珍惜，安諾君只能幫到你這里了~ 海闊心無界，山高人為峰，站在巨人的肩膀上繼續(xù)乘風(fēng)破浪，讓微生物組的研究成果真正走向千家萬戶，走向諾貝爾獎的領(lǐng)獎臺~ 最后致我們辛勤的科研工作者，科研順利~
本圖來源于網(wǎng)絡(luò)，侵權(quán)立刪 PS：大家可以猜猜這是哪個實驗室的杰作，下期安諾君會揭曉答案~ [1]Zhao L. The gut microbiota and obesity: from correlation tocausality[J]. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11(9): 639-647. [2]Wang J, Jia H. Metagenome-wide association studies: fine-mining themicrobiome[J]. Nature Reviews Microbiology, 2016, 14(8): 508-522. [3]Gilbert J A, Quinn R A, Debelius J, et al. Microbiome-wide association studies link dynamic microbial consortia to disease[J]. Nature, 2016, 535(7610): 94-103. [4]Qin J, Li Y, Cai Z, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J]. Nature,2012, 490(7418): 55-60. [5]Yu J, Feng Q, Wong S H, et al. Metagenomic analysis of faecal microbiomeas a tool towards targeted non-invasive biomarkers for colorectal cancer[J]. Gut, 2015, 33(5): 905-12. [6]Nielsen H B, Almeida M, Juncker A S, et al. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes[J]. Nature Biotechnology, 2014, 32(8): 822-828. [7]Zhang X, Zhang D, Jia H, et al.The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment.[J]. Nature Medicine, 2015, 21(8): 895-905. |
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