可以直接導(dǎo)入之前電腦中已安裝的Rscript，也可以重新安裝。

Rscript插入路徑為：所安裝的R語(yǔ)言包路徑，R語(yǔ)言包中bin文件夾下的Rscript.exe。比如E:\R\R-3.5.0\bin。

點(diǎn)擊小工具下方的啟動(dòng)軟件，就可以安裝所需的小工具，并且會(huì)同時(shí)打開(kāi)。為了避免網(wǎng)速問(wèn)題導(dǎo)致拖延后續(xù)分析時(shí)間，建議先將所需工具打開(kāi)一次，安裝好小工具。

安裝好了以后進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)下載及差異分析。

● 首先是TCGA數(shù)據(jù)的下載

● 接著下載數(shù)據(jù)選擇及合并

● 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理：【啟動(dòng)軟件】-【選擇矩陣】-【TPM】-【轉(zhuǎn)換并導(dǎo)出】

● 數(shù)據(jù)ID轉(zhuǎn)換

● 準(zhǔn)備分組文件

在使用生信人工具盒做TCGA差異分析時(shí)，需要自己手動(dòng)準(zhǔn)備分組文件。

● 根據(jù)TCGA編號(hào)判斷樣本類型

TCGA的樣本編號(hào)有自己的一個(gè)特征，例如在本例中樣本編號(hào)方式為：TCGA-3T-AA9L-01。

在這個(gè)編號(hào)中，TCGA表示該數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有樣本均以TCGA為開(kāi)頭，3T表示組織來(lái)源編碼，不同的字母和數(shù)字表示不同的組織來(lái)源；

比如3T表示該組織來(lái)自于Emory University（https://gdc./resources-tcga-users/tcga-code-tables/tissue-source-site-codes），AA9L則表示該樣本來(lái)源的參與者編號(hào)。

最關(guān)鍵的是第四位的數(shù)字，它表示樣本類型，在TCGA中，01-09編號(hào)表示腫瘤，10-19表示正常對(duì)照（https://gdc./resources-tcga-users/tcga-code-tables/sample-type-codes），在TCGA樣本名中，這個(gè)位置最常見(jiàn)的就是01和11。

因此，通過(guò)對(duì)TCGA樣本命名編號(hào)，可以對(duì)每個(gè)樣本的類型進(jìn)行判斷。

● 接著對(duì)樣本進(jìn)行分類

如果對(duì)每一個(gè)樣本編號(hào)進(jìn)行查看，然后進(jìn)行分組，工作量會(huì)非常大。利用Excel自帶的篩選工具，可以快速的篩查出編號(hào)為01或編號(hào)為11的樣本。

● 差異基因分析

logFC下的負(fù)數(shù)表示該基因在腫瘤組中低表達(dá)，正數(shù)表示該基因在腫瘤組中高表達(dá)。

● 差異基因熱圖，火山圖等

獲得差異基因數(shù)據(jù)后，就可以相應(yīng)的繪制火山圖，熱圖等。具體操作步驟和之前分享過(guò)的利用工具盒對(duì)GEO數(shù)據(jù)差異分析中的方法一致。

注意事項(xiàng)及難點(diǎn)：

● 生信人工具盒需要升級(jí)，并且升級(jí)后不能直接利用工具盒下載Rscript，因?yàn)楣ぞ吆心壳斑€不能自動(dòng)識(shí)別所下載的Rscript目錄，因此需要手動(dòng)下載并導(dǎo)入。

● 下載TCGA數(shù)據(jù)時(shí)，需要注意選擇數(shù)據(jù)類型，目前生信人工具盒對(duì)數(shù)據(jù)類型分成了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，甲基化數(shù)據(jù)等，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，不同的數(shù)據(jù)類型，進(jìn)行差異分析時(shí)選擇的方法是不同的。

● 數(shù)據(jù)下載時(shí)要同時(shí)選擇癌旁組織和癌組織，并且要注意，在所選擇的腫瘤中，包含有癌胖組織的數(shù)據(jù)。

● 在進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換時(shí)，注意TCGA轉(zhuǎn)換方式中的選擇，下載的數(shù)據(jù)為HTSeq-FPKM時(shí)，選擇編碼基因或長(zhǎng)非編碼基因，下載的數(shù)據(jù)為miRNA profiling。isoform數(shù)據(jù)時(shí)，選擇miRNA。

● 對(duì)TCGA樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分組時(shí)，一定要注意樣本編號(hào)，如果分組出現(xiàn)錯(cuò)誤，后續(xù)所有差異分析結(jié)果都是不可用的。