外泌體 (Exosome)是由細胞主動向外分泌的雙層囊泡小體，直徑介于30至150納米，由大多數(shù)細胞分泌，攜帶蛋白質、脂質和RNAs等，介導體內不同細胞類型之間的細胞間通訊，從而影響正常和病理狀態(tài)【1, 2】。隨著外泌體研究的興起，越來越多的證據(jù)表明外泌體可攜帶具有完整酶活性的蛋白酶，然而其功能有待研究【3】。

圖片引自：https:///exosome-rna-seq-primer/

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 是一種以持續(xù)氣流受限為特征的進行性疾病，其發(fā)病率及病死率均較高。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，COPD將在2020年位居全球主要死亡原因第3位及世界疾病經濟負擔第5位【4】。因此，研究 COPD的發(fā)生和發(fā)展過程、形態(tài)學與功能變化特點，對COPD的治療具有重要意義。嗜中性粒細胞 (polymorphonuclear leukocyte, PMN) 來源的蛋白酶在某些慢性肺部炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用【5】。蛋白酶-抗蛋白酶失衡學說是COPD發(fā)病機制的經典學說之一，當?shù)鞍酌负涂沟鞍酌傅恼Ｆ胶鉅顟B(tài)被打破，蛋白酶大量釋放，導致細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 破壞增加，進而導致COPD和支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)【5, 6】。在COPD的蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)中，活化嗜中性粒細胞 (PMN) 來源的絲氨酸蛋白酶—中性粒細胞彈性蛋白酶 (neutrophil elastase, NE)和內源性抗蛋白酶—α1抗胰蛋白酶 (a1-antitrypsin, a1AT) 發(fā)揮著重要作用【7】。然而關于NE是如何繞過a1AT破壞ECM引起肺部疾病的分子機制尚不清楚。

近期，美國阿拉巴馬大學伯明翰分校的James Edwin Blalock課題組在Cell發(fā)表題為Activated PMN Exosomes: Pathogenic Entities Causing Matrix Destruction and Disease in the Lung的研究，發(fā)現(xiàn)活化嗜中性粒細胞來源的外泌體通過釋放具有活性的中性粒細胞彈性蛋白酶NE，破壞細胞外基質，進而促進肺部炎性疾病的發(fā)生。

研究人員利用細菌趨藥性多肽 (formyl-methionine-leucine-phenylalanine, fMLP)活化嗜中性粒細胞（PMN）后提取外泌體，稱為激活外泌體 (activated exosomes)，相對應的對照組外泌體稱為休眠外泌體 (quiescent exosomes)。研究發(fā)現(xiàn)休眠外泌體與激活外泌體在分子直徑，數(shù)目以及形態(tài)上均無明顯差異，但活化PMN相關蛋白在激活外泌體中高表達，且其表面NE含量較休眠外泌體顯著增加 (89.2% vs 1%)。隨后研究人員利用western blot, mass spectroscopy 和FACS證實PMN來源的激活外泌體NE具有溶解彈性纖維的能力，而且這種外泌體表面NE可以抵抗a1AT的抑制作用。此外，活化的外泌體NE還通過整合蛋白Mac-1水解I型膠原酶，這種膠原酶在肺部含量最為豐富。

隨后，研究人員將從志愿者血液PMN提取的外泌體注入到小鼠氣管內，發(fā)現(xiàn)激活外泌體可以誘導小鼠發(fā)生COPD。注射三天后可明顯觀察到肺泡擴張，且單次注射可使該癥狀至少持續(xù)3周，可導致肺氣腫。這種肺泡擴張是外泌體數(shù)量依賴的，且NE是激活外泌體引起肺泡擴張的主要因素。通過對人原發(fā)性氣道上皮細胞來源的激活和休眠外泌體進行RNA測序和mRNA信號通路分析發(fā)現(xiàn)，二者在mRNA水平僅存在細微差異，且這種細微差異并不是激活外泌體引起肺泡擴張的原因，即說明激活外泌體NE通過直接水解ECM引起肺泡擴張。為了排除PMN激活劑的影響，研究人員還采用了其他的PMN激活劑，提取的激活外泌體具有相似的功能活性。

研究人員分別從正常不吸煙自愿者與COPD患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中提取了外泌體，分別注入小鼠氣管內，發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，COPD患者BALF來源的外泌體可明顯誘導小鼠肺泡擴張和右心室肥大 (right ventricular hypertrophy, RVH)。NE的抑制劑II可明顯抑制COPD患者BALF來源外泌體引起的肺氣腫，表明NE在外泌體引起的肺氣腫中發(fā)揮著重要作用，且這些引起肺部疾病的外泌體表達CD66b，而非MUC4。研究發(fā)現(xiàn)，NE抑制劑II可大部分抑制COPD患者BALF來源的外泌體導致的肺氣腫 (70%-75%)，但可以完全抑制CD66b陽性的外泌體引起的肺氣腫，表明其余不表達CD66b的外泌體通過非NE依賴的方式引起不明顯的致病性癥狀。研究人員還發(fā)現(xiàn)不僅COPD患者來源的外泌體可引起小鼠肺氣腫，支氣管肺發(fā)育不良(BPD) 患者來源的外泌體也可以誘導肺部疾病，強調了該通路在嗜中性肺疾病中的通用性，同時發(fā)現(xiàn)了外泌體在破壞ECM平衡誘導COPD和BPD（支氣管發(fā)育不良）的新作用，為嗜中性肺疾病的治療提供了新思路。

1. Simon, C., et al., Extracellular Vesicles in Human Reproduction in Health and Disease. Endocr Rev, 2018. 39(3): p. 292-332.

2. Reategui, E., et al., Engineered nanointerfaces for microfluidic isolation and molecular profiling of tumor-specific extracellular vesicles. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 175.

3. Szul, T., et al., Toll-Like Receptor 4 Engagement Mediates Prolyl Endopeptidase Release from Airway Epithelia via Exosomes. Am J Respir Cell Mol Biol, 2016. 54(3): p. 359-69.

4. Lord, D. and S. Washington, Introduction, in Safe Mobility: Challenges, Methodology and Solutions. 2018, Emerald Publishing Limited. p. 1-10.

5. Russell, D.W., A. Gaggar, and G.M. Solomon, Neutrophil Fates in Bronchiectasis and Alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Ann Am Thorac Soc, 2016. 13 Suppl 2: p. S123-9.

6. Senior, R.M., et al., The induction of pulmonary emphysema with human leukocyte elastase. Am Rev Respir Dis, 1977. 116(3): p. 469-75.

7. Sng, J.J., et al., MMP-8, MMP-9 and Neutrophil Elastase in Peripheral Blood and Exhaled Breath Condensate in COPD. COPD, 2017. 14(2): p. 238-244.