轉(zhuǎn)錄組測序，無疑是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域大家最熟悉、使用最多的組學(xué)技術(shù)之一。轉(zhuǎn)錄組測序可以為我們?nèi)娴靥峁颖緝?nèi)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的信息。通過常用的分析方法(例如表達(dá)差異分析、功能分析等)，我們可以快速知曉樣本間的轉(zhuǎn)錄差異的總體規(guī)律(例如，樣本間的差異主要涉及哪些通路，發(fā)生在細(xì)胞的哪些位置)。

但轉(zhuǎn)錄組測序的不足也是顯而易見的。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組測序結(jié)果本身就是一張表格，我們無法直接獲知基因間錯綜復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。但當(dāng)你想進(jìn)一步理清一些更關(guān)鍵的問題，就會遇到困難，例如：這些基因間的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系是什么？導(dǎo)致這些成百上千的基因發(fā)生變化的關(guān)鍵驅(qū)動基因是什么？回答以上的這些問題非常重要。

因?yàn)椤案蓾窠Y(jié)合”是后組學(xué)時代研究的主旋律，如果我們無法從一堆轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中找到核心調(diào)控點(diǎn)，那么測序數(shù)據(jù)就無法有效、準(zhǔn)確地指導(dǎo)我們進(jìn)行下一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?！稗D(zhuǎn)錄組測完了，現(xiàn)在我該做什么？”相信很多測過序的人都曾有過這樣的疑問。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測序需要結(jié)合多組學(xué)才有利于找到核心調(diào)控關(guān)系

從另一個角度來考慮，細(xì)胞內(nèi)部本身是一個非常復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)。當(dāng)我們只使用轉(zhuǎn)錄組這一種組學(xué)信息，那么情形自然就如同盲人摸象，從少量有限的信息難以理清事物的本質(zhì)。好在我們不僅僅只有一種工具，結(jié)合其他不同維度的組學(xué)信息，例如DNA組學(xué)的變異信息，蛋白組學(xué)，表觀組學(xué)等，通過不同組學(xué)的貫穿分析，往往可以幫助我們縮小范圍，找到核心調(diào)控點(diǎn)。

圖2 DNA與RNA之間有很多變化可能發(fā)生

在眾多可能性中，轉(zhuǎn)錄前調(diào)控起著非常重要的作用。因?yàn)閺腄NA到RNA之間有一片巨大的“舞臺”——染色質(zhì)。如果把染色質(zhì)比作一片“草原”的話，這片草原中生存著眾多 “表觀/轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子”的“物種”。這片草原中發(fā)生著的“物種”之間復(fù)雜的競爭、協(xié)同作用，其精彩程度絕不亞于非洲大草原。我們先來看看，染色質(zhì)這片草原的“核心植被”大概長什么樣子。

這片草原“植被”的基本結(jié)構(gòu)是由DNA纏繞著核小體構(gòu)成。核小體是由H3、H4、H2A和H2B四種組蛋白構(gòu)成的八聚物。DNA繞行核小體一圈的長度大概是147bp。我們都知道DNA是關(guān)鍵遺傳物質(zhì)，但這些DNA所依附的核小體絕對是不可忽略的物質(zhì)。在以上的DNA-核小體的基本架構(gòu)的基礎(chǔ)上，很多調(diào)控分子在這片草原生機(jī)勃勃地生長起來。我們這里要提到4類關(guān)鍵的調(diào)控因素。

圖3 染色質(zhì)“草原”生機(jī)勃勃

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors）的重要性自然毋庸置疑。我們都知道在啟動轉(zhuǎn)錄前，需要轉(zhuǎn)錄因子這種特別的蛋白結(jié)合在DNA上，進(jìn)而招募其他的關(guān)鍵分子（例如RNA聚合酶II）進(jìn)一步全面啟動轉(zhuǎn)錄。那么轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，是非常重要的步驟。但結(jié)合本身意味著需要空間，類似我們要在地鐵里坐下，前提是地鐵里有空位。

轉(zhuǎn)錄因子要在DNA上“坐下”就意味著DNA上有空位。但如果上文提到的，大部分DNA區(qū)域與核小體纏繞著，這意味著這些DNA區(qū)域是沒有“空位”的。要讓轉(zhuǎn)錄因子能夠正確工作，那么就要求基因組DNA某些區(qū)域不與核小體纏繞，處于“開放”狀態(tài)。

所以，我們將這種不被核小體占據(jù)，對轉(zhuǎn)錄因子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的結(jié)合處于開放狀態(tài)的區(qū)域，稱為開放染色質(zhì)區(qū)（open chromatin）。相對應(yīng)的，被核小體占據(jù)，對轉(zhuǎn)錄因子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的結(jié)合處于拒絕狀態(tài)的區(qū)域，稱為閉合染色質(zhì)區(qū)（Closed chromatin）。這種染色質(zhì)的開放和閉合狀態(tài)，也對應(yīng)這些區(qū)域?qū)φ{(diào)控蛋白的可接近（從而進(jìn)一步結(jié)合）程度。所以，我們將這種狀態(tài)也稱為染色質(zhì)可接近性（chromatin accessibility）。

染色質(zhì)的開放性和可接近性，可以認(rèn)為是一個概念。下文如果我混用兩個名詞，大家不要感到意外。那些高可接近性的開放染色質(zhì)區(qū)通常位于啟動子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)。關(guān)于這兩個區(qū)域的特點(diǎn)，我們下文會介紹。

大部分高等生物都有上千種轉(zhuǎn)錄因子（人類大概2000種），構(gòu)成了復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這大概是染色質(zhì)這片草原上，多樣性最高的“物種”了。但無論這個網(wǎng)絡(luò)多復(fù)雜，只有靶基因的啟動子開放，對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子才能發(fā)揮它們的功能。

圖4 開放染色質(zhì)與關(guān)閉染色質(zhì)區(qū)對調(diào)控蛋白的親和力不同

既然特定區(qū)域（尤其啟動子區(qū)）染色體開放與否直接關(guān)系到基因的轉(zhuǎn)錄激活與沉默，那么通過調(diào)控，改變特定區(qū)域的核小體狀態(tài)就非常重要了——這就是核小體重塑（nucleosome remodelling）。

核小體重塑包括核小體的移動（挪動核小體在染色體上的位置）或重新拆裝（將特定區(qū)域的核小體解離或重新合成安裝上）。這些過程都是通過特定的蛋白復(fù)合物來完成，從而保證特定的染色體區(qū)域可以在開啟和關(guān)閉之間切換。

圖5 核小體狀態(tài)是可改變的

核小體是否被重塑，也是很大程度由其自身的成分決定的。核小體成分的改變包含了組蛋白亞型和組蛋白修飾兩大因素。上文我們提到，雖然核小體是八聚物，由四大類組蛋白構(gòu)成。

但特定類型組蛋白，依然存在變異體（由不同基因編碼）。例如，組蛋白H2A和H3，分別存在變異體H2A.Z和H3.3。這兩種變異體構(gòu)成的核小體通常較為不穩(wěn)定，便于染色質(zhì)開放性的高低調(diào)控。

而在組蛋白內(nèi)部，也存在不同類型的化學(xué)修飾。比如，我們?nèi)绻fH3K4me3，意思就是說H3組蛋白的第3個賴氨酸（K）上有3個位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。H3K27ac，意思就是說H3組蛋白的第27個賴氨酸（K）上發(fā)生了乙?；?。這些組蛋白的化學(xué)修飾，也會影響核小體的靜電荷，從而影響核小體與DNA，核小體與其他蛋白的結(jié)合能力。

DNA甲基化是另外一個我們所熟悉的表觀修飾形式。在高等生物里，我們談DNA甲基化，通常默認(rèn)是5mC甲基化這種類型。很顯然，DNA甲基化類似組蛋白修飾一樣，也會改變DNA的靜電荷，從而改變DNA分子與其他蛋白分子的結(jié)合能力。

雖然DNA甲基化可能直接與轉(zhuǎn)錄因子互作從而影響基因的轉(zhuǎn)錄，但更多情況下DNA甲基化是與組蛋白修飾配合，通過一套復(fù)雜的關(guān)系影響基因轉(zhuǎn)錄。在我們的omicshare課堂《DNA甲基化與多組學(xué)貫穿分析》中，我們也詳細(xì)討論兩者的潛在關(guān)系。

總之，DNA甲基化影響基因轉(zhuǎn)錄的方式非常復(fù)雜，不是簡單的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系，而是受組蛋白修飾類型、所在的基因區(qū)等多因素的影響。

圖6 來自O(shè)S課堂《DNA甲基化與多組學(xué)貫穿分析》的截圖

課堂鏈接：http://www./class/home/index/series?id=12

上文，我們已經(jīng)提到了啟動子（promoter）和增強(qiáng)子（enhancer）區(qū)，是基因組中最常見的開放區(qū)。其中，啟動子區(qū)是大部分人熟悉的，就是位于基因上游轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近的一段調(diào)控基因起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。

而增強(qiáng)子大家可能略微陌生一些，簡單說來就是離基因通常更遠(yuǎn)，主要通過激活特定啟動子而起到調(diào)控作用的基因組元件。如圖7b，增強(qiáng)子可以通過被一系列（有轉(zhuǎn)錄激活能力的）調(diào)控蛋白結(jié)合而間接與下游啟動子結(jié)合，從而激活下游啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

簡單來說，啟動子是激活下游基因轉(zhuǎn)錄的元件，增強(qiáng)子是激活啟動子的元件。無論啟動子還是增強(qiáng)子要起作用，前提是該區(qū)域處于核小體開放狀態(tài)，可以被其他調(diào)控蛋白接近并結(jié)合。

如何判斷一個區(qū)域是有活性的啟動子還是增強(qiáng)子呢？首先，其必須是該區(qū)域處于開放的狀態(tài)（后續(xù)我們會介紹染色體開放性檢測的方法）；其次，啟動子一般在TSS區(qū)附近，而增強(qiáng)區(qū)則可能離TSS區(qū)較遠(yuǎn)；再次，這些區(qū)域?qū)?yīng)特定的組蛋白或DNA甲基化修飾狀態(tài)。例如，增強(qiáng)子區(qū)常見的組蛋白修飾方式是：H3K4me1/2（單甲基化或二甲基化），H3k27ac，而啟動子區(qū)附近的組蛋白一般帶有H3k4me3修飾。

有這樣的一系列線索，我們就可以找到染色質(zhì)草原水草最豐美的地方——處于激活狀態(tài)的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)。這些地方，就是草原上的生物—— 轉(zhuǎn)錄因子等各類調(diào)控蛋白最愛來的地方。以這些地方為線索，我們就能揭開在特定組織、細(xì)胞內(nèi)部，各類分子相互調(diào)控背后的核心秘密。

圖7 啟動子與增強(qiáng)子示意圖

在非洲大草原上，動物們隨著旱季和雨季變化，逐水草而居，在自然環(huán)境面前更多是被動適應(yīng)。但在染色質(zhì)這個大草原上，轉(zhuǎn)錄因子們則要強(qiáng)大地多——它們還可以反向改變草原的植被。

因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子在結(jié)合DNA的同時，也會逆向影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致局部基因組開放性的改變。對于轉(zhuǎn)錄活躍的基因（圖8a）, 啟動子區(qū)通常處于開放狀態(tài)，從而讓轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合啟動子激活轉(zhuǎn)錄。對于暫時處于沉默狀態(tài)但可以被誘導(dǎo)激活的基因（圖8b），我們將會看到轉(zhuǎn)錄因子如何反向改變局部染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這個過程有三個步驟：

（1）雖然該基因的啟動子區(qū)處于關(guān)閉狀態(tài)，但處于核小體間的DNA連接區(qū)（linker）處于弱可接近的狀態(tài)。這些區(qū)域如果存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，那么一些轉(zhuǎn)錄因子就可以結(jié)合在這個區(qū)域。這些轉(zhuǎn)錄因子被稱為先導(dǎo)（Pioneering）轉(zhuǎn)錄因子。

（2）隨著先導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，會招募其他的核小體重塑和修飾復(fù)合物的結(jié)合，進(jìn)一步將周邊染色質(zhì)從閉合改變?yōu)殚_放狀態(tài)。

（3）隨著區(qū)域開放性的提高，原先與核小體纏繞的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，讓繼發(fā)（Secondary）轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在這個區(qū)域，從而全面激活這個區(qū)域的轉(zhuǎn)錄。

在這里我們可以看到，轉(zhuǎn)錄因子有點(diǎn)類似人類。人類可以在一處地方開墾和定居，從而改變某個區(qū)域的植被和地貌。但如果因?yàn)閼?zhàn)爭或其他原因?qū)е戮用襁w走，那么人類定居點(diǎn)會重新轉(zhuǎn)入荒蕪狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子與核小體也存在動態(tài)拉鋸的關(guān)系，從而使基因可誘導(dǎo)區(qū)的開放性處于動態(tài)變化過程。

圖8 轉(zhuǎn)錄因子會反向改變“水草”的分布。圖中DNA上的紅點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

通過上面的文章，我們已經(jīng)看到了在染色質(zhì)這個大草原上，轉(zhuǎn)錄因子們作為生態(tài)鏈非常重要的一部分，與其他影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的因素持續(xù)相互作用，從而調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。但我們也看到了，這些因素間的兩兩互作（圖9左半部）構(gòu)成了一個非常繁雜的系統(tǒng)。

當(dāng)我們看到下游基因轉(zhuǎn)錄的變化，實(shí)際上是上游各種復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄組測序后，我們找不到頭緒，不知道導(dǎo)致這些變化的關(guān)鍵因素是什么，這是非常正常的困惑。因?yàn)槿鐖D9，這個調(diào)控如同一個杠桿，兩側(cè)的信息量都非常巨大。如果你從轉(zhuǎn)錄組直接切入尋找上游，意味著無數(shù)的可能。

以轉(zhuǎn)錄因子為例，人體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子約有兩千種。那么，對一個轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)數(shù)據(jù)，我們應(yīng)該選擇哪個轉(zhuǎn)錄因子下手呢？轉(zhuǎn)錄因子CHIP-seq的實(shí)驗(yàn)難度這么大，我們怎么能夠保證一擊必中呢？（非模式物種，還面臨沒有抗體的問題。不過后續(xù)我們會介紹DAP-seq這個能繞過抗體制備的非模式物種“替代性CHIP-seq“的方法）

又比如，如果從DNA甲基化和組蛋白修飾入手，那更是一鍋復(fù)雜的亂燉（常見的組蛋白修飾就有很多種，DNA甲基化與組蛋白修飾又有復(fù)雜的互作關(guān)系）。

那么我們有更好的思路嗎？

要想在轉(zhuǎn)錄前調(diào)控的主戰(zhàn)場——染色質(zhì)這片草原上縱橫馳騁，意味著我們需要獵手一樣敏銳的嗅覺和正確的方法。如果你是國家地理的攝影師，編輯部老板正催著你下周交稿，你會怎么做？

還繼續(xù)開著悍馬漫無目的地在非洲大草原上馳騁嗎？那樣的話，你有大概率拍不到什么好片子。那應(yīng)該去哪里？當(dāng)然去水草最豐美的地方。原因有兩點(diǎn)：

（1）你可以最短時間得到有效的信息

在水源地，角馬蹬羚要來飲水，獵豹獅子要來狩獵，你可以在最短的時間內(nèi)獲知當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵信息（有多少物種，種群多大，誰是王者）。

（2）為下一步的深入追蹤提供可能

如果你不滿足于只看動物喝水，則可以在它們喝完水后繼續(xù)深入追蹤它們的族群生活。至于你希望拍攝獅群內(nèi)部的競爭合作關(guān)系，還是斑鬣狗特別的生殖方式，完全是你的選擇。

圖9 染色質(zhì)開放性的變化是轉(zhuǎn)錄組前調(diào)控的核心節(jié)點(diǎn)

同樣的，在染色質(zhì)這片草原上，也有一片水草豐美的地方，那就是染色質(zhì)可變開放區(qū)（通常是啟動子和增強(qiáng)子區(qū)）。如果你是轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的”獵手”，很顯然你應(yīng)該拿上長槍短炮先蹲守在這些地方。原因同樣有兩點(diǎn)：

（1）你可以用最簡潔的方式，得到最有效的關(guān)鍵信息

無論最上游調(diào)控因子變化多么復(fù)雜，方式多么多樣，它們要影響基因轉(zhuǎn)錄，必須經(jīng)過染色質(zhì)開放區(qū)。因此，關(guān)注可變開放區(qū)可以讓你暫時化繁為簡，直接知曉哪些基因的調(diào)控區(qū)發(fā)生了開放性的變化，開放區(qū)有哪些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

（2）為下一步的深入追蹤提供可能

當(dāng)你抓住了關(guān)鍵可變開放區(qū)的基礎(chǔ)信息，下一步你大可以進(jìn)入上游，窺視在這個區(qū)域周邊生活的物種（轉(zhuǎn)錄因子）如何與影響染色質(zhì)“環(huán)境”的環(huán)境因子（組蛋白修飾、DNA甲基化等）斗智斗勇，更加深入系統(tǒng)地解析染色質(zhì)這片草原上發(fā)生著的故事，然后快樂地發(fā)高分paper。

圖10 基因組可接近性的常見高通量檢測方法

好了，說了這么多，大家可能會對基因組可接近性研究非常感興趣了。實(shí)際上，在這個領(lǐng)域已經(jīng)有非常成熟的可以進(jìn)行全基因組水平開放染色質(zhì)檢測的方法。例如，DNase-seq、MNase、ATAC-seq等。在周四的微信文章中，我們將繼續(xù)為你介紹這些基因組可接近性檢測方法的原理和區(qū)別。

另外，周四的微信文章中，我們將有一個驚喜公布給大家，敬請期待。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cedar H, Bergman Y. Linking DNA methylation and histonemodification: patterns and paradigms[J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10(5):295.

[2] Bell O, Tiwari V K, Thom? N H, et al. Determinants anddynamics of genome accessibility[J]. Nature Reviews Genetics, 2011, 12(8): 554.

[3] Ong C T, Corces V G. Enhancer function: newinsights into the regulation of tissue-specific gene expression[J]. NatureReviews Genetics, 2011, 12(4): 283.