很高興又見面了！ 上期中我和大家聊了聊，和常規(guī)流速HPLC比較（為了介紹方便，本文中的HPLC都特指常規(guī)流速HPLC），MicroLC在靶向定量中對靈敏度的提高。通過兩方面應(yīng)用案例的分享， 大家了解到兩個方面的內(nèi)容：1是MicroLC能提高大部分ESI源檢測化合物的靈敏度，特別是肽類化合物；2是當(dāng)上百種化合物同時測定時，MicroLC也能幫助69%的化合物，靈敏度提高2-20倍，從而提高了實際樣本的目標(biāo)化合物檢出覆蓋率； 至于MicroLC能將S/N提高多少倍，則需要考慮化合物的基質(zhì)干擾和本底噪音的情況，低本底噪音的化合物更有可能獲得良好的S/N。 本期是上期內(nèi)容的姊妹篇，將從兩個角度介紹MicroLC, 一方面是: MicroLC是否能應(yīng)用于非靶向研究？ 另一方面是: 與NanoLC比較，MicroLC在工業(yè)化、大樣本量蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用。又相關(guān)應(yīng)用需求的同志們，可以仔細(xì)聽一聽了。

第一個方面，在靶向檢測中，和常規(guī)流速HPLC比較，MicroLC提高了靈敏度。那自然而然的應(yīng)用需求就產(chǎn)生了，非靶向研究也需要提高靈敏度，但MicroLC是否有足夠好的RT穩(wěn)定性和噴霧穩(wěn)定性，來完成非靶向研究呢？一篇測試文獻(xiàn)^[5]，給出了答案，MicroLC聯(lián)用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行非靶向脂質(zhì)組學(xué)研究，樣本運行時間7.5 min，5針人血漿樣品重復(fù)進(jìn)樣，上千種脂質(zhì)化合物的RT的CV偏差為0.01%--0.18%，質(zhì)譜峰強(qiáng)度CV偏差為2.9%-18%，完全符合非靶向組學(xué)方法要求。

圖1. MicroLC組學(xué)樣品應(yīng)用：A）非靶向脂質(zhì)組學(xué)^【1】，展示部分脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)MicroLC條件下的S/N提高， 實驗結(jié)果表明：13個脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)S/N平均提高24倍；B)人血漿樣本重復(fù)進(jìn)樣5次，色譜圖RT (CV% 0.01%-0.18%) 和質(zhì)譜峰強(qiáng)度（CV% 2.9%-18%）展示良好穩(wěn)定性。

這里，分享一個MicroLC在代謝組學(xué)應(yīng)用的實際案例。作者Yan[2]研究六種紅酒的多酚代謝組學(xué)，質(zhì)譜使用非靶采集模式，液相使用MicroLC，流速50uL/min, 4min的梯度，快速準(zhǔn)確鑒定165個多酚化合物，多維統(tǒng)計分析結(jié)果為多酚化合物和口感風(fēng)味的相關(guān)性提供了研究基礎(chǔ)。

第二個方面，上期和剛剛聊到的內(nèi)容一直集中在MicroLC對比常規(guī)流速HPLC性能而言；那么大家也會想到，和NanoLC比較，MicroLC通量提高后，靈敏度和穩(wěn)定性如何呢？

在蛋白組學(xué)研究中，為了提高樣本通量和降低檢測成本，適應(yīng)工業(yè)化、大批量樣本的蛋白組學(xué)研究要求，文獻(xiàn)作者Jakob^【2】開發(fā)MicroLC-SWATH-MS方法（SWATH?技術(shù)是SCIEX公司的專利技術(shù)，在后面的專欄中，我再為大家介紹這個技術(shù)），考察不同運行時間，對1750個酵母目標(biāo)蛋白定量。結(jié)果表明：5 μg酵母蛋白，在3 μL/min流速下，運行時間30 min,45 min和60 min，蛋白的檢出量分別為：1170個， 1322個，1470個，也就是分別檢出了目標(biāo)蛋白的67%，75%和81%；這一結(jié)果表明：使用MicroLC顯著縮短檢測時間后，靈敏度也能支持上千個蛋白被檢出。

另外，作者在5個月時間內(nèi)，對327個酵母樣品進(jìn)行MicroLC分批采集，采用25 min的運行時間，對QC樣本中的750多個蛋白定量分析，結(jié)果表明：使用 MicroLC方法， 這750多個蛋白的批內(nèi)和批間標(biāo)準(zhǔn)偏差均<20%。最終，作者總結(jié)MicroLC-SWATH-MS方法無論是在測定性能還是在節(jié)省成本方面，非常適合工業(yè)化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。（這里補(bǔ)充一下，SWATH蛋白定量的通量取決于IDA鑒定的結(jié)果，實際工作中，建議使用二維液相，大大提高蛋白覆蓋率，也就能相應(yīng)提高定量通量了。）

圖2.  文獻(xiàn)作者Jakob^【2】開發(fā)MicroLC-SWATH-MS方法：E). 1750個目標(biāo)酵母蛋白，進(jìn)不同μg酵母蛋白，MicroLC-SWATH-MS方法檢出蛋白個數(shù)；F）MicroLC不同運行時間，1750個目標(biāo)酵母蛋白，檢出蛋白個數(shù)；運行時間30 min,45 min和60 min，蛋白的檢出量分別為：1170個， 1322個，1470個；M) 展示327個酵母樣品，分3個批次，MicroLC-SWATH-MS采集的RT穩(wěn)定性；6個iRT肽段的平均保留時間標(biāo)準(zhǔn)差為17.7 s；N) MicroLC-SWATH-MS大序列樣本，不同時間RT穩(wěn)定性；P) 展示327個酵母樣品，分3批次進(jìn)樣，MicroLC-SWATH-MS批內(nèi)和批間的重現(xiàn)性，批內(nèi)大約為12%；批間為17.4%。 

聽了上期和本期的案例分享，大家可能有個疑問。 既然MicroLC在靈敏度，通量，試劑和樣品消耗量上有這么多好處， 為什么MicroLC并沒有被廣泛應(yīng)用呢？ 其實早在20多年前，科學(xué)界的專家們就意識到了MicroLC的技術(shù)優(yōu)勢，并發(fā)表了相關(guān)論文。但一個技術(shù)從出生到成熟，需要一個發(fā)展的過程。

以前，MicroLC的使用難點在于：1. 沒有專用，易于拆卸的微升流速的離子源或噴針，造成使用上的困難或噴霧不穩(wěn)定；您可能聽說過Nano源，但沒聽說過微升流速源，實際上，不同噴霧流速，合適的噴針內(nèi)徑和離子源設(shè)計對噴霧的穩(wěn)定至關(guān)重要。2. 難于更好地控制死體積，或突破性的設(shè)計保證系統(tǒng)的穩(wěn)定和易操作性；3. 微升色譜柱型號的匱乏和進(jìn)樣量的限制；但隨著科學(xué)界和工業(yè)界不斷地完善MicroLC及其相關(guān)產(chǎn)品設(shè)計和工藝，現(xiàn)在MicroLC技術(shù)取得了長足的發(fā)展。

我所在的SCIEX公司，也在不斷開發(fā)和革新MicroLC的硬件和軟性應(yīng)用。在去年ASMS（美國質(zhì)譜年會）上，推出了我們的第三代微升液相M5和與其相配套的Optiflow^TM微升噴霧源。針對上述3個問題的解決，又向前邁進(jìn)了一大步。首先，更專業(yè)，便于使用的Optiflow^TM微升噴霧源使得測定結(jié)果更穩(wěn)定；其次，M5 系統(tǒng)使用更合理的管路設(shè)計，大大減少了死體積和使用者的不便；最后，Trap-Elute二維泵系統(tǒng)大大提高了樣品上樣量，助力靈敏度的提高。