題記：本文以計算藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)為例詳細(xì)介紹基于GraphPad Prism軟件實現(xiàn)非線性擬合并繪圖。

1. 背景介紹

這里“非線性擬合”或許名詞太過于專業(yè)，對于很多讀者來說可能有些陌生，但我想很多讀者有過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的經(jīng)歷，這也是一種“曲線擬合”，只不過標(biāo)準(zhǔn)曲線制作多為“線性擬合”，擬合的方程也比較簡單，比如：Y=aX b。很多時候兩個變量的關(guān)系并非簡單的直線關(guān)系，這種情況下擬合曲線就顯得復(fù)雜一點。至少要滿足兩點條件才可以進(jìn)行曲線擬合：第一，二維坐標(biāo)系中有適當(dāng)數(shù)量的點，可大體反應(yīng)曲線的形狀；第二，根據(jù)坐標(biāo)系中的點擬合曲線的數(shù)學(xué)公式已知。曲線擬合之后到底有什么作用？我們先從簡單的線性擬合說起，比如我們按照Y=aX b這個方程進(jìn)行線性擬合，當(dāng)我們在坐標(biāo)系中確定兩個點以后，那么這條直線在這個坐標(biāo)系中就是確定的了（兩點決定一條直線），那么方程中的參數(shù)a、b也是確定的了，當(dāng)我們獲得a、b這兩個參數(shù)以后，這個方程對我們來說就是有價值的，我們可以根據(jù)任意X取值而計算出Y值。

當(dāng)然，以上是一個線性擬合的例子，理解起來要簡單一點。再舉一個略顯復(fù)雜的例子，我們需要根據(jù)下面的方程來擬合曲線并計算某化學(xué)藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50），方程如下：Y=Bottom (Top-Bottom)/(1 10^((LogIC50-X)*HillSlope))，該方程已不再是簡單的線性關(guān)系，其中有四個參數(shù)：Top、Bottom、IC50和HillSlope，如果要確定方程中的這四個參數(shù)，我們首先需要在二維坐標(biāo)系中獲得適量的坐標(biāo)點，然后找到一條最佳的曲線，讓這條曲線盡可能通過所有的點，曲線一旦確定那么這幾個參數(shù)就確定了，則可得到IC50的值。讀者朋友們面臨的問題可能比這更復(fù)雜，但處理原則是類似的。下面我們就以案例的形式為大家演示曲線擬合的過程，本案例的數(shù)據(jù)來自筆者本人的研究數(shù)據(jù)[1]，為了便于讀者閱讀和理解，筆者對數(shù)據(jù)進(jìn)行了簡化處理。

2. 案例詳解

【案例1】計算藥物IC50。乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種數(shù)量一致。待細(xì)胞貼壁后我們使用不同濃度梯度的藥物A（0~800 μmol/L）處理乳腺癌細(xì)胞24小時，然后通過CCK-8法測定各接種細(xì)胞孔的吸光度值，吸光度值越大表示存活細(xì)胞越多。我們的實驗?zāi)康氖菙M合劑量-存活曲線并計算藥物的IC50值。以0 μmol/L藥物處理孔的細(xì)胞的存活率為1，其他各濃度的吸光度值與0 μmol/L藥物孔的比值即為相對存活率。根據(jù)藥物濃度與對應(yīng)的相對存活率在二維坐標(biāo)系中描點，按照Y=Bottom (Top-Bottom)/(1 10^((LogIC50-X)*HillSlope))方程擬合劑量存活曲線，計算方程中的參數(shù)。該實驗在相同的條件下進(jìn)行了三次獨(dú)立的重復(fù)實驗，假定每次獨(dú)立重復(fù)實驗設(shè)有3個復(fù)孔，那每個藥物濃度應(yīng)該有9個測量數(shù)據(jù)，本案例中我們對數(shù)據(jù)進(jìn)行了簡化處理，僅選擇了三次獨(dú)立重復(fù)實驗的單個培養(yǎng)孔的吸光度值并計算相對存活率。試劑空白對照設(shè)置等實驗操作細(xì)節(jié)可參考CCK-8試劑盒的說明書，本案例重點講解數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析過程。數(shù)據(jù)整理如下表1所示。

表1.不同藥物A濃度梯度處理乳腺癌細(xì)胞的相對存活率

接下來我們將表1中的數(shù)據(jù)按照如下圖1~圖3所示操作步驟錄入Graphpad Prism 7.0 軟件（San Diego, CA, USA）并繪制散點圖，初步判斷曲線形狀。接下來的分析策略是通過繪制的散點圖進(jìn)行曲線擬合。第一步，我們首先對A的濃度進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，生成新的數(shù)據(jù)集，如圖4~圖6所示。使用新生成的數(shù)據(jù)集擬合曲線并計算IC50，如圖7~圖11所示。

圖1. 新建數(shù)據(jù)框。依次選擇“XY”-“Enter/importdata”選擇第二行填入數(shù)字“3”，表示每組有3個獨(dú)立樣本或3次獨(dú)立重復(fù)實驗數(shù)據(jù)。

圖2. 錄入數(shù)據(jù)。

圖3. 選擇繪制散點圖。如圖示選擇繪制圖形類型設(shè)置誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差（SD）點擊“OK”

圖4. 對藥物濃度進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。如圖示依次選擇“Analyze”-“Transform”點擊“OK”。

圖5. 對藥物濃度進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。如圖示操作，勾選“Standardfunction”-“TransformX values using”選擇對數(shù)轉(zhuǎn)換公式勾選“Newgraph”復(fù)選框點擊“OK”。

圖6. 對藥物濃度進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后新生成的數(shù)據(jù)集。

圖7. 非線性擬合。如圖示依次選擇“Analyze”→“XYanalyses”→“Nonlinear regression (curvefit)”→點擊“OK”。

圖8. 非線性擬合。如圖示依次選擇“Fit”→“Choosean equation”→“Dose-response-Inhibition”→“l(fā)og(inhibitor) vs. response--Variableslope (four parameters)”→點擊“OK”。其他選項默認(rèn)。假定如果讀者想通過某一藥物濃度計算存活率，可以勾選“Interpolate”。

注意：此處軟件提供了四個公式，筆者推薦選擇第二個公式，即“l(fā)og(inhibitor)vs. response--Variable slope (four parameters)”。選擇第一個公式的操作與本例類似，選擇其他公式與本例操作不同，讀者可自行嘗試。

圖9. 計算IC50公式的細(xì)節(jié)。假定讀者想了解關(guān)于擬合方程的細(xì)節(jié)可以點擊圖8右側(cè)的“Details”，可以了解公式中每個參數(shù)的具體含義。軟件自帶的非線性擬合方程是有限的，假定讀者有特殊要求，有時需要自己定義公式，可點擊上圖8右側(cè)“New”新建公式，并給公式的參數(shù)設(shè)定初始值，在下一篇中筆者將進(jìn)行詳細(xì)講解。

圖10. 曲線擬合計算結(jié)果。軟件會根據(jù)坐標(biāo)系中的描點計算公式中的參數(shù)。

圖11. 最后繪制的劑量存活率曲線。筆者通過在軟件中設(shè)置坐標(biāo)系和圖形參數(shù)獲得上圖，讀者可以自行按照前述章節(jié)方法嘗試。

3. 總結(jié)

本文詳細(xì)講解了基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)中非線性擬合的實現(xiàn)方法。軟件自帶擬合公式，如果軟件中不提供公式，我們需要自建公式，下一講我們將分享自定義公式的曲線擬合。曲線擬合的難點在于我們對具體方程參數(shù)的理解，而具體操作步驟并不難。當(dāng)我們實驗獲得了一些原始數(shù)據(jù)，可以在二維坐標(biāo)系中描出點來，按照既定的方程就可以把曲線擬合出來，到底該選擇什么樣的方程或者自定義什么樣的方程？這些工作需要我們結(jié)合自己的實驗?zāi)康囊约拔墨I(xiàn)回顧來確定。事實上非線性擬合是一個很復(fù)雜的數(shù)學(xué)問題，我們僅僅介紹了其中與我們醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)處理相關(guān)的一些內(nèi)容。

我們提出一個問題供讀者思考：假定，我們有大量的原始數(shù)據(jù)，可以在坐標(biāo)系中描出很多點，但我們并不知道這些點背后的數(shù)學(xué)規(guī)律是什么，或者其遵守什么樣的數(shù)學(xué)模型，那該如何擬合曲線呢？這樣的問題應(yīng)該歸于當(dāng)下比較流行的數(shù)據(jù)挖掘、統(tǒng)計建模等范疇，要比我們本章節(jié)講述的要復(fù)雜得多。

4. 參考文獻(xiàn)

[1]. 周支瑞,胡志德.聰明統(tǒng)計學(xué). 長沙:中南大學(xué)出版社, 2016.

[2]. 周支瑞,胡志德.瘋狂統(tǒng)計學(xué). 長沙:中南大學(xué)出版社, 2018.