 大家都很熟悉常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，，就是檢測特定時(shí)空下樣品的基因表達(dá)量，但對表觀領(lǐng)域的新秀ATAC-seq，特別是單細(xì)胞ATAC-seq，可能很多人都會(huì)或多或少的有些困惑，就像我這位馬老師，開口就問，單細(xì)胞ATAC-seq有啥用！我簡單的解釋了兩句，她也不是很清楚，所以就有了這篇推文。 很 I 高 I 興 I 你 I 能 I 來  希 I 望 I 你 I 別 I 離 I 開 接下來的內(nèi)容分三步走： 第一步，介紹基本概念； 第二步，介紹常規(guī)的ATAC-seq； 第三步，介紹10x單細(xì)胞ATAC-seq。 01  基本概念   圖 1. 常染色質(zhì)（Euchromatin)和異染色質(zhì)（Heterochromatin) （圖片出處） 你我都是細(xì)胞構(gòu)成的，而細(xì)胞又分為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在由磷脂雙分子包裹的細(xì)胞核里，有重要的遺傳物質(zhì)-染色質(zhì)，這本質(zhì)上決定了你是誰，O(∩_∩)O哈哈哈~哈哈哈！ 核小體、蛋白質(zhì)和RNA態(tài)，轉(zhuǎn)錄活性高的物質(zhì)構(gòu)成了染色質(zhì)，在細(xì)胞核中染色質(zhì)中有兩種狀態(tài)：一種是常染色質(zhì)，壓縮程度低，處于松散的狀于核的中間；一種是異染色質(zhì)，壓縮程度高，高度壓縮，轉(zhuǎn)錄活性很低，位于核周邊（圖 1 ）。 以前我認(rèn)為ATAC-seq技術(shù)就是來研究常染色質(zhì)的，但我是錯(cuò)的。常染色質(zhì)占整個(gè)基因90%（點(diǎn)擊查看詳情），而通過ATAC-seq等技術(shù)獲得的“open chromatin”只占整個(gè)基因組的1%-9%，所以常染色質(zhì)≠“open chromatin”【1】【2】。“open chromatin”被翻譯成開放染色質(zhì)，它由DNase-seq and FAIRE-seq這個(gè)兩種技術(shù)所定義，就是在基因組范圍內(nèi)核小體缺失處的DNA片段，這個(gè)位置因?yàn)闆]有組蛋白八聚體占位，所以是裸漏的，其他的蛋白和酶容易接近這個(gè)位置，所以這樣的位置通常是轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，比如enhancers, promoters, insulators, and locus control regions【3】。通過ATAC-seq等技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)獲得這些調(diào)控元件，將有助于我們理解一個(gè)基因在一個(gè)特定時(shí)空是如何被表達(dá)調(diào)控的。 02 什么是ATAC-seq？  ATAC-seq is short for An Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing. 2013年Greenleaf發(fā)了第一篇ATAC-seq的文章，在他的文章里，提到了ATAC-seq可以做的三件事【4】：  那么ATAC-seq這個(gè)實(shí)驗(yàn)怎么做？ 首先提取完整的細(xì)胞核，Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)入通透性增加的細(xì)胞核內(nèi)，隨機(jī)的進(jìn)入開放染色質(zhì)位置，將DNA片段切斷，并將Tn5酶所帶的adaptor(藍(lán)紅短棒）皆在DNA片段的末端，兩個(gè)酶分子就切下來一個(gè)DNA片段，并且兩端都帶著已知的adaptor。 將這樣的片段富集，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建文庫就可以測序，測序后將片段化的DNA片段回帖到基因組上就可以知道哪些位置是開放的（圖 2）！ 接下來要通過生息的分析，找到差異的開放位點(diǎn)，motif 分析，以及和RNA-seq聯(lián)合分析。 別問我具體的咋分析，這是一個(gè)實(shí)事求是的問題，非得讓我說點(diǎn)什么，那我只能告訴你，看人家文獻(xiàn)畫了什么圖，你就畫什么圖就好了。  圖 2. ATAC反應(yīng)的卡通圖 03 10x單細(xì)胞ATAC-seq 以上介紹的是Bulk ATAC，什么意思那，就是做實(shí)驗(yàn)時(shí)取了很多細(xì)胞一起來做實(shí)驗(yàn)，最后拿到的結(jié)果是所有細(xì)胞的信號值累加，通過bulk ATAC是找共性，但大家都知道，組織是具有異質(zhì)性的，那么bulk ATAC這個(gè)時(shí)候就不行了，而10x genomics在18年推出的單細(xì)胞ATAC就能解決這個(gè)異質(zhì)性的問題。那么10x單細(xì)胞ATAC的原理是什么那? 單細(xì)胞核懸液通過10x的儀器進(jìn)行分選并打上特異的標(biāo)記，這樣獲得的數(shù)據(jù)就來自每一個(gè)細(xì)胞核。大體的實(shí)驗(yàn)過程就是在上儀器前，制備細(xì)胞核懸液，然后用Tn5酶處理細(xì)胞核，上機(jī)進(jìn)行分選打標(biāo)記，測序，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，目前分析的軟件主要是用10x提供的cellranger-ATAC進(jìn)行分析（圖 3）。  圖 3. 單細(xì)胞ATAC-seq流程圖 單細(xì)胞數(shù)據(jù)出來后，最主要的就是做t-SNE聚類，將細(xì)胞進(jìn)行分群，找到新的亞群。分群的依據(jù)就是根據(jù)差異的開放區(qū)域不同，將細(xì)胞分成不同的群。Bulk ATAC-seq的功能分析都能套用到單細(xì)胞ATAC-seq上，具體怎么操作也要具體問題具體分析。 本質(zhì)上講，單細(xì)胞ATAC-seq能解決異質(zhì)性問題。另外，單細(xì)胞ATAC是一個(gè)新的技術(shù)，增加文章的創(chuàng)新性，好發(fā)文章，但別問我用了這個(gè)技術(shù)能發(fā)幾分的文章，這我說了不算，是由編輯和reviewer決定的。 早安 午安 晚安  參考文獻(xiàn)
文字 / 劉師兄 排版 / 大璐 圖片 / 網(wǎng)絡(luò) |
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