Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing（ATAC-Seq）即利用轉(zhuǎn)座酶探究可接近性染色質(zhì)高通量測序技術(shù)。通俗來說就是利用轉(zhuǎn)座酶來獲取開放性染色質(zhì)，再通過高通量測序及生物信息學分析來挖掘相關(guān)基因信息，以此探究生物學相關(guān)問題。

Q：為什么研究染色質(zhì)開放區(qū)域？

A：染色質(zhì)分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，在結(jié)構(gòu)上常染色質(zhì)折疊壓縮程度低，處于伸展狀態(tài)，DNA復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄都發(fā)生在DNA的致密高級結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮⒌臓顟B(tài)；這部分打開的染色質(zhì)，就叫開放染色質(zhì)（open chromatin）。而打開的染色質(zhì)，就有足夠的區(qū)域允許一些調(diào)控蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子）過來與之相結(jié)合。而染色質(zhì)的這種特性，就叫做染色質(zhì)的可接近性（chromatin accessibility）。通過研究細胞特定狀態(tài)下開放的染色質(zhì)區(qū)域可以在DNA水平上了解其轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

Q：如何尋找開放的染色質(zhì)區(qū)域？

A：傳統(tǒng)使用的的實驗方法主要是有MNase-seq和DNase-seq ，這兩種實驗方法的主要思路是：染色質(zhì)變得開放，就意味著DNA和組蛋白的聚集程度降低，就會有一部分DNA暴露出來。而一旦失去了蛋白質(zhì)的保護，這部分DNA就可以被DNA酶（MNase或DNase I）所切割。然后，我們再把切割完的DNA拿來測序，和已知的全基因組序列相比較，就能發(fā)現(xiàn)被切割的是哪些序列，沒有被切掉的基因序列又在哪里，就知道開放的染色質(zhì)區(qū)域在哪里了。不過，這兩個方法有明顯的缺陷，即耗時費力與重復(fù)性差。雖然FAIRE-seq 不依賴酶和抗體，但其檢測背景較高，測序信噪比低，甲醛交聯(lián)時間不好把握等缺陷，限制其使用范圍。

Q：有什么新技術(shù)方法來研究開放染色質(zhì)？

A：新推出的ATAC-seq利用Tn5轉(zhuǎn)座酶（DNA轉(zhuǎn)座，是一種把DNA序列從染色體的一個區(qū)域搬運到另外一個區(qū)域的現(xiàn)象，這一過程就由轉(zhuǎn)座酶參與完成。Tn5轉(zhuǎn)座酶：“標簽片段化工具”，Tn5轉(zhuǎn)座體可將其銜接子負載整合到可接近的染色質(zhì)區(qū)域，而空間位阻較不可接近的染色質(zhì)使得轉(zhuǎn)座不可能發(fā)生。）人為將將攜帶已知DNA序列標簽的轉(zhuǎn)座復(fù)合物，加入到細胞核中，再利用已知序列的標簽進行PCR建庫測序，就知道哪些區(qū)域是開放染色質(zhì)了。ATAC-seq出來的結(jié)果，和傳統(tǒng)方法出來的結(jié)果具有很強的一致性，同時也和ChIP-seq有較高的吻合程度。而相比較而言，ATAC-seq的重復(fù)性，比MNase-seq和DNase-seq的更強，操作起來也更加簡便，而且只需要很少的細胞/組織量，同時測序信號更加好。目前已經(jīng)成為研究染色質(zhì)開放性首選的技術(shù)方法。

Q：ATAC-seq主要優(yōu)勢是什么？

A：面對現(xiàn)實需求ATAC-seq有以下四個方面的強大優(yōu)勢：

•  靈敏性高：低細胞起始量（500-50000個）；

•  操作簡單，耗時短；

•  實驗重復(fù)性好：技術(shù)重復(fù)間表現(xiàn)出非常好的可重復(fù)性( R = 0.98) ，并與DHs 測序數(shù)據(jù)間也有著較好的一致性(R＞0.79)；

•  能同時揭示開放染色質(zhì)的基因組位置，DNA結(jié)合蛋白，轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點的相互作用

Q：ATAC-seq能用在那哪些方面？

A：結(jié)合ATAC-seq優(yōu)勢以及研究熱潮ATAC-seq有以下用途；當然進一步的開發(fā)也可能在不久的將來讓其使用更加廣泛。

1. 非生物逆境，病蟲害，營養(yǎng)，激素等處理前后及動物疾病，轉(zhuǎn)錄活性差異。

2. 不同組織，器官轉(zhuǎn)錄活性差異，找到組織特異基因和啟動子。

3. 利用ATAC-seq技術(shù)來研究A、B、D三個亞基因組的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的差異，從而研究同源基因的表達調(diào)控差異。而六倍體與二倍體、四倍體等位基因間調(diào)控位點的比較。

4 通過ATAC-seq定義的open chromatin區(qū)域 ，再結(jié)合motif 分析，識別哪種轉(zhuǎn)錄因子參與了基因表達調(diào)控（對于抗體質(zhì)量不好的TF，尤其有效）

5 而將ATAC-seq和RNA-seq進行整合研究，將會獲得對生物體（動物或植物）中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制；宏觀分析細胞在該特定時空下整個基因組的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

Q：ATAC-seq 有哪些缺陷呢？

A：任何技術(shù)都有其限制因素，ATAC-seq也不例外；

1. Tn5通過插入剪斷DNA 并將測序接頭連接到剪斷的兩個DNA 片段的末端，因此對于一個DNA 片段而言，其兩端的接頭連接是隨機的，這便導(dǎo)致同一片段兩端的接頭有50%的概率是同一接頭。而只有連接不同接頭的片段才可用于富集擴增及測序，因此，有一半的片段無法利用；

2. 大量剪斷的DNA 由于片段過大，無法進行PCR富集;

3. Tn5 的活性受反應(yīng)溶液的組成及反應(yīng)條件影響，仍然需要優(yōu)化以便提高剪切效果；

4. ATAC-seq在植物細胞中存在以下難點：細胞壁的存在，葉綠體、線粒體等細胞器的污染，缺少穩(wěn)定遺傳的細胞系;

Q：現(xiàn)在用ATAC-seq發(fā)表文章多么？ 

A：ATAC-seq在2013年問世，文章數(shù)量逐年增加，2018年剛開年就已經(jīng)有近10篇文章已經(jīng)發(fā)表；把握機會讓您的研究如虎添翼。

Q：ATAC-seq文章推薦

A：ATAC-seq文章數(shù)量不斷增長，希望下一篇就是您的杰作。

[1] Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., & Kaestner, K. H. (2016). Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Mol Metab, 5(3), 233-244. doi: 10.1016/j.molmet.2016.01.002

從55歲的男性病人中獲取了一種新的食管癌細胞系：MFD-1，采用ATAC-seq方法與經(jīng)典的食道癌細胞系OE33和人食管上皮細胞HET1A比較差異，進行MFD-1癌細胞特性研究，繪制MFD-1染色質(zhì)開放位點圖譜。和正常上皮細胞相比，MFD-1特異的染色質(zhì)開放位點顯著富集著CTCF、NFY、Meis3 、Nrf2 的motif，且這些位點附近基因富集在和上皮癌及消化道腫瘤相關(guān)的功能分組內(nèi)。

結(jié)合全基因組測序（WGS）和表達譜測序（RNA-seq）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)細胞系中4 個基因(ABCB1, DOCK2, SEMA5A 和TP53）存在5個突變位點，提供了MFD-1的基因表達特性。說明MFD-1能作為一種代表性的臨床前原發(fā)性食管癌模式細胞系，可用于對應(yīng)突變類型的研究。

[2] Tan, L., Ke, Z., Tombline, G., Macoretta, N., Hayes, K., Tian, X. Gorbunova, V. (2017). Naked Mole Rat Cells Have a Stable Epigenome that Resists iPSC Reprogramming. Stem Cell Reports, 9(5), 1721-1734. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.10.001

成年裸鼴鼠skin fibroblasts (NSF)的iPSC誘導(dǎo)率顯著低于小鼠mouse skin fibroblasts (MSF)。篩選了12個能提高重編程效率的因子，發(fā)現(xiàn)其中的LT（一種能夠抑制Rb基因表達的東西）能提高裸鼴鼠的iPSC誘導(dǎo)效率。

此研究首先用組蛋白修飾ChIP-qPCR和組蛋白質(zhì)譜對比了裸鼴鼠和小鼠組蛋白修飾的差異，又用ATAC-seq查看了開放區(qū)的差異。ATAC-seq結(jié)果跟前面復(fù)雜的組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的結(jié)果非常符合ATAC-seq分析結(jié)果。

ATAC-seq實驗表明：裸鼴鼠中重編程基因的promoter區(qū)跟小鼠比起來處于一種都關(guān)起來了（more closed）的狀態(tài)，表達LT之后（LT可以抑制Rb, 提高重編程效率），發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠這些基因的promoter區(qū)又大量開放了（massive opening）。

結(jié)論：裸鼴鼠具有更加穩(wěn)定的表觀基因組，這一特征幫助它抵抗脫分化，從而為抗癌和長壽做出了貢獻。

Q：ATAC-seq送樣標準？

A：ATAC-seq因其限制性因素較少樣品準備也變得簡單，以下是其送樣標準：

1. 樣本要求

1)新鮮細胞

細胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，在運輸前灌滿培養(yǎng)基，室溫運輸。

具體要求為：細胞數(shù)量>20 萬，細胞狀態(tài)良好無污染。

2)凍存細胞

培養(yǎng)細胞進行計數(shù)，按照5*10⁴個細胞每管進行分裝，分裝好的細胞 4℃、500 G 離心 5 min；PBS洗滌，4℃、500G離心5min。小心吸去全部液體，將細胞沉淀用液氮進行速凍，干冰運輸。

具體要求:細胞嚴格按照 5*10⁴每管分裝，每個樣品分裝三管。

3)動物組織

新鮮的組織取到1.5ml EP管中，用液氮進行速凍，干冰運輸。 動物組織質(zhì)量應(yīng)當>1g，并且組織新鮮無降解，無結(jié)締組織或血塊存在。

4)植物組織

選取新鮮的植物組織，用液氮進行速凍，干冰運輸。 盡量選取新鮮的嫩葉或者花等作為實驗樣品，樣品量盡可能多;樣品應(yīng)保證新鮮。

2. 樣品包裝

所有的容器應(yīng)當用parafilm進行封口

注意：

生物學重復(fù)：2-4次

測序深度：100 M以上，保證50 M 有效reads

樣本要求：ATAC-seq實驗對于細胞數(shù)量和質(zhì)量有著嚴格的要求，實驗的成敗很大程度上細胞的狀態(tài)以及細胞量與Tn5轉(zhuǎn)座酶的比例。若細胞狀態(tài)差，污染嚴重，那么測序的結(jié)果會出現(xiàn)很大的偏差。若果細胞數(shù)量過少，過多的酶會進行過度的切割，導(dǎo)致測序結(jié)果異常；而細胞量過多可能導(dǎo)致切割不充分，使得原本應(yīng)當測到的開放區(qū)域未被測出。

Q：ATAC-seq-數(shù)據(jù)交付及周期

A：ATAC-seq數(shù)據(jù)質(zhì)控標準：

①采用PE50測序策略數(shù)據(jù)量滿足要求clean data≥50M clean reads（特別注意研究轉(zhuǎn)錄因子測序數(shù)據(jù)量需要≥200M）；

②Q20 ≥ 80% ;

交付周期：45個工作日（樣本數(shù)≤20個）；大項目周期需評估溝通。