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做科研最痛苦的是什么？是每周被導師追問N次實驗進展？還是拿到被同行批到懷疑人生的審稿意見？付出巨大的努力卻收獲不到理想的結果才是最令人痛苦的。明明付出了比別人更多的努力，為什么發(fā)表的文章沒人家的好？如果能用更短的時間找到功能更強的基因，是不是就能讓自己的努力更有意義？同樣的工作量，同樣的努力，用在研究功能更強的基因和分子上一定會起到事半功倍的效果。 找到功能強大的基因和分子開展研究是生物 醫(yī)學科研的最關鍵的一步。 如何找到功能強大的基因和分子？ 1月13日Nature Genetics在線發(fā)表的一篇文章的做法非常值得學習，他們使用Cas-9高通量文庫的方法通過設計篩選模型直接得到篩選模型對應的功能基因ARID1A（[1]）。   文章內(nèi)容簡介 ARID1A是染色質(zhì)重塑復合體SWI/SNF的一個亞基成分。ARID1A是ER陽性乳腺癌中SWI/SNF復合體最經(jīng)常發(fā)生突變的亞基。作者發(fā)現(xiàn)ARID1在內(nèi)分泌耐受的ER陽性乳腺癌中ARID1A經(jīng)常會失活突變。基于CRISPR/Cas9高通量篩選文庫，作者發(fā)現(xiàn)ARID1A在篩選ER降解劑藥物Fulvestrant耐藥相關基因中是打分最高的候選基因。ARID1A的失活可明顯導致ER降解劑藥物耐藥，并可促進乳腺癌從ER依賴的luminal型向ER不依賴的basal-like型的轉(zhuǎn)變。機制方面，ARID1A的失活可導致SWI/SNF復合體對幾個luminal lineage決定性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用出現(xiàn)異常，這些轉(zhuǎn)錄因子包括ER，F(xiàn)OXA1和GATA3。ARID1A的失活還能在全基因組層面改變ER-FOXA1與染色質(zhì)的相互作用以及ER依賴的轉(zhuǎn)錄活性。本文的工作發(fā)現(xiàn)并證明了ARID1A在內(nèi)分泌治療中的關鍵作用，以及ARID1A在維持ER 陽性乳腺癌luminal類型中的作用。 關于原文中如何驗證ARID1A的表達和功能的，感興趣的讀者可以直接拜讀原文。就像題目所提到的，ARID1A的功能這么強，作者是怎么把它找出來的？下面就簡單介紹一下高通量文庫篩選技術： 什么是高通量文庫篩選技術？ 本文的工作非常嚴謹扎實，最重要的一步就是通過高通量文庫基于功能篩選得到ARID1A基因，后面的驗證和功能機制研究工作都是基于這個基礎而開展的。那么這種高通量文庫技術是如何實現(xiàn)基于功能的篩選的？  本文的高通量Cas9文庫和工作原理剖析 本文中提到的CRISPR/Cas9高通量篩選文庫是比較常用的高通量功能篩選工具，文中用的文庫是靶向914種表觀遺傳調(diào)控相關基因的Cas9文庫，每個基因設計了平均12條sgRNA。這些sgRNA被批量化合成后一起包裝到病毒載體中，并進一步包裝成一種病毒混合物（這里面包含了所有設計的sgRNA分子，每一個病毒只攜帶一種三個RNA序列，因此這個文庫病毒是攜帶所有類型sgRNA的病毒混合物）。作者在此前已經(jīng)構建好了能穩(wěn)定表達Cas9蛋白的細胞株，用上面的這個病毒感染這個細胞株，通過調(diào)整細胞和病毒滴度的比例，實現(xiàn)理論上一個細胞只接觸并被一個病毒分子感染，病毒準確感染了細胞后就可以整合到基因組中。到這一步，細胞群體中會存在感染了不同sgRNA的細胞個體，每個細胞只攜帶一種，細胞群體就可以包含所有sgRNA類型的細胞。作者讓這些感染后的細胞先穩(wěn)定生長兩周，這樣每個細胞中sgRNA和Cas9蛋白發(fā)揮作用，就會把對應的基因給敲除掉。整個細胞群就會存在敲出了不同基因的細胞。在這個基礎上，分別用Fulvestrant處理，DMSO為對照，細胞會因為被敲除的基因不一樣而表現(xiàn)出對藥物敏感性的變化，最終會體現(xiàn)在細胞比例的變化。最后再通過收集兩組細胞的基因組，通過比較藥物處理組特異性富集和特異性丟失的基因，就可以找出功能基因。  圖1 Cas9文庫篩選功能基因 （[1]） 這種高通量文庫篩選體系稱為“Pooled Screening”，就是從一群細胞和文庫分子中直接篩選候選基因的方法。 Pooled Screening文庫應用綜述 Pooled Screening文庫已經(jīng)在生物醫(yī)學研究中發(fā)揮了非常重要的作用，在細胞生長，細胞信號通路，病毒感染機制，藥物作用機制以及腫瘤免疫，表觀遺傳等等非常多的領域中得到了廣泛應用。不僅僅上面提到的CRISPR/Cas9技術可以實現(xiàn)高通量Pooled Screening文庫，shRNA，DNA Barcode分子都可以設計成這種高通量文庫。關于高通量文庫的技術和應用可以詳細閱讀下面的這篇綜述（[2]）  作為近年來的明星分子 連續(xù)3年榮登生物科學領域新興前沿方向的TOP1寶座 什么樣的高通量篩選文庫適合circRNA？ 高通量Pooled Screening文庫這么好用，能不能用到circRNA的研究中呢？什么樣的文庫能在circRNA中使用？2019年的一篇Cell文章就曾經(jīng)用過高通量的shRNA文庫進行功能性circRNA的篩選（[3]）。  這項工作中作者用到的是針對circRNA的shRNA文庫，篩選對前列腺癌生長所必須的essential circRNA，這些essential circRNA被干擾之后，細胞增殖顯著抑制甚至細胞會發(fā)生死亡（[3]）。作者在這項工作中共分析到了171種essential circRNA，選擇了10個進行干擾和過表達驗證，結果表明所篩選到的circRNA在細胞增殖中的作用非常顯著。  圖2 基于shRNA文庫篩選前列腺癌essential circRNA （[3]） 看到這里，大家一定會眼前一亮，功能這么強的circRNA分子原來也可以用這個辦法來找！但需要注意的是，因為絕大部分circRNA是從mRNA的外顯子反向剪切形成的，要保證只下調(diào)circRNA而不影響對應的mRNA，只能在反向拼接位點來設計，因此只有shRNA才能保證只對circRNA起作用而不影響對應的mRNA。Cas9是mRNA敲除的重要技術，但目前在circRNA中應用還非常有限，只有個別circRNA可以通過設計實驗并驗證后實現(xiàn)敲除，目前還沒法實現(xiàn)全基因組進行大規(guī)模的circRNA敲除而不影響對應的mRNA，因此Cas9文庫還不適合circRNA。目前只有shRNA文庫適合功能circRNA的篩選！circRNA種類多，shRNA合成費時費力且費用高，目前國內(nèi)也有成品化的shRNA文庫，Geneseed的SCL-1，包含11930種shRNA分子，靶向1485個circRNA和對應的1050個來源基因mRNA，且靶向來源基因mRNA的shRNA均避開對應circRNA的序列，可以滿足大家通過高通量文庫技術篩選功能circRNA的需求。 參考文獻 1. Xu, G., et al., ARID1A determines luminal identity and therapeutic response in estrogen-receptor-positive breast cancer. Nat Genet, 2020. 52(2): p. 198-207. 2. Schuster, A., et al., RNAi/CRISPR Screens: from a Pool to a Valid Hit. Trends Biotechnol, 2019. 37(1): p. 38-55. 3. Chen, S., et al., Widespread and Functional RNA Circularization in Localized Prostate Cancer. Cell, 2019. 176(4): p. 831-843 e22. |
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