【原】生物分析專欄 | 單克隆抗體藥物的藥代動力學(xué)和生物分析

醫(yī)藥魔方 2020-11-06

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生物技術(shù)藥物的興起始于1982年，F(xiàn)DA當(dāng)年批準(zhǔn)了第一個基因重組藥物Humulin（重組人胰島素）上市。這是生物技術(shù)藥物發(fā)展的元年，是藥物獲取手段從化學(xué)合成或者中藥提取走向通過生物技術(shù)手段獲得的標(biāo)志性事件。1986年，第一個治療性單克隆抗體藥物Orthoclone OKT3獲批上市，拉開了單克隆抗體藥物發(fā)展的序幕。隨后，從1997年嵌合型抗體美羅華出現(xiàn)，到2002年實現(xiàn)全人源化的修美樂獲批上市，以及接下來不到20年的時間里，ADC、雙特異性抗體、單域抗體等相繼獲批，眾多新的治療策略從科學(xué)概念逐步走向臨床。目前，美國FDA累計批準(zhǔn)上市了94個單抗類藥物（截止至2020年7月14日），幾乎占據(jù)生物技術(shù)藥物的半壁江山。

不同于小分子化學(xué)藥物，單抗藥物是基于疾病相關(guān)靶點及其信號通路進(jìn)行設(shè)計?？赏ㄟ^非共價作用與靶點發(fā)生可逆的、高親和性的結(jié)合，引起阻斷或激活作用進(jìn)而調(diào)控下游生物學(xué)效應(yīng)而產(chǎn)生藥效或/和副作用。相比小分子藥物，單抗具有靶點選擇性高、特異性強、臨床療效確切等特點，適應(yīng)癥涉及腫瘤、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病、眼科疾病、罕見病等。在單抗藥物的開發(fā)過程中，了解單抗靶點介導(dǎo)的藥代動力學(xué)特點，獲得體內(nèi)靶點及藥物濃度水平，對于深入理解藥物與靶點相互作用對PD指標(biāo)或/和臨床終點的影響、評價潛在的生物標(biāo)志物、闡明量效關(guān)系、探究PK/PD相關(guān)性等意義非凡。本文將從靶點的類型、單抗的藥代動力學(xué)特點、單抗藥代的影響因素及單抗的生物分析幾個方面進(jìn)行闡述。

一、靶點類型

生物靶點為能夠與藥物分子結(jié)合并產(chǎn)生藥理效應(yīng)的生物大分子。這些靶點存在于機體靶器官細(xì)胞膜上或體液內(nèi)，主要有受體、配體、酶、離子通道和核酸。

受體多為糖蛋白，一般至少包括兩個功能區(qū)域，即與配體結(jié)合的區(qū)域和產(chǎn)生效應(yīng)的區(qū)域。受體通過識別和選擇性結(jié)合配體（Ligand）（信號分子），改變構(gòu)象而產(chǎn)生活性，啟動一系列過程，最終表現(xiàn)為生物學(xué)效應(yīng)。受體有細(xì)胞膜受體如離子通道偶聯(lián)受體、G-蛋白偶聯(lián)受體；細(xì)胞內(nèi)受體如細(xì)胞漿受體和細(xì)胞核受體。配體是能與受體產(chǎn)生特異性結(jié)合的生物活性分子，包括體內(nèi)的生物活性物質(zhì)（如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、信息分子）以及外源性的生物活性物質(zhì)如藥物。

靶點的分布和調(diào)控關(guān)乎治療的精準(zhǔn)性和療效。許多配體和受體都參與了細(xì)胞的生長增殖，在某個生理部位或者疾病狀態(tài)下靶點表達(dá)會發(fā)生變化，因此藥物可以通過選擇性地與受體結(jié)合，發(fā)揮激活或者阻斷受體活性而達(dá)到治療目的。單抗與靶點結(jié)合引起下游信號通路的變化和/或介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒（ADCC）效應(yīng)和補體依賴細(xì)胞毒作用（CDC）等效應(yīng)功能。單抗藥物能否發(fā)揮作用與靶點的類型有關(guān)，若受體表達(dá)在實體瘤上，藥物發(fā)揮作用會受諸多因素影響，如由血管內(nèi)皮至組織的滲透率、循環(huán)時間、內(nèi)皮的通透性、靜水壓、內(nèi)皮細(xì)胞上靶點的表達(dá)等等；而靶向可溶性靶點可以避免這個問題，但也面臨其它挑戰(zhàn)，如阻斷該靶點是否影響正常生理功能或者產(chǎn)生毒副作用等。因此了解靶點的類型及特點，有助于我們更直觀地理解靶點與藥物相互作用方式，以及深刻認(rèn)識靶點對藥物的處置特性。

根據(jù)靶點存在的位置，可將其分為膜靶點（Membrane-bound target）和可溶性靶點（Soluble ligand），如圖1所示，下面將對其特點進(jìn)行介紹。

圖1 單抗藥物靶點的類型[Expert Opin. Drug Metab. Toxicol, 2012]

1 膜靶點

膜靶點即細(xì)胞表面的受體，存在于細(xì)胞膜表面，能與配體特異性結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，如EGFR、HER2、PD-1、PDL-1和CTLA-4等。細(xì)胞膜表面的受體（簡稱膜受體）會根據(jù)細(xì)胞的功能狀態(tài)發(fā)生變化以維持受體的動態(tài)平衡。膜受體會通過循環(huán)或降解途徑持續(xù)內(nèi)化。受體的內(nèi)化是指受體蛋白通過質(zhì)膜凹陷從而脫離細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過程，內(nèi)化后受體失活，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程可能中斷，也可能會進(jìn)一步調(diào)控下游效應(yīng)器。有些藥物可以下調(diào)細(xì)胞表面的受體，通過降低受體的作用而增加療效。持續(xù)給藥可能會降低細(xì)胞表面靶點的凈數(shù)量，從而影響療效。如果藥物的作用機制是ADCC或者CDC時，則希望抗原抗體復(fù)合物的內(nèi)化作用較弱，以最大程度地招募免疫效應(yīng)細(xì)胞或者補體而發(fā)揮作用。

膜結(jié)合蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（Extracellular domains，ECD）會脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)即為可脫落靶點。同時以膜結(jié)合和可溶性兩種形式在體內(nèi)存在的靶點如：CD20、CD25、CD52、EGFR、HER2以及CTLA4。在一些腫瘤和炎癥疾病中可觀察到脫落受體水平的提高，并且會受到給藥等因素的影響。循環(huán)中脫落靶點水平的升高會與疾病進(jìn)程息息相關(guān)，如HER2。同時，膜靶點的受體占位（Receptor occupancy, RO）也會受到可脫落靶點水平的影響。脫落的受體可能會因為占據(jù)了藥物的結(jié)合位點，使藥物與膜靶點結(jié)合的可能性降低，從而降低藥物的療效。還有些受體會分泌調(diào)節(jié)不表達(dá)該受體的細(xì)胞的相關(guān)功能，如IL-6和可溶性IL6-Rα復(fù)合物會通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機制，與β-受體gp130結(jié)合刺激不表達(dá)IL6-Rα的細(xì)胞。通常，可溶性靶點和可脫落靶點不會作為直接的靶點募集的生物標(biāo)志物，某些情況下會用來預(yù)測疾病。通過檢測循環(huán)系統(tǒng)中的受體水平有助于我們了解疾病的表現(xiàn)及其發(fā)展進(jìn)程。此外，不同的人細(xì)胞膜脫落靶點的程度也各不相同。

2 可溶性靶點

可溶性配體可以通過與循環(huán)系統(tǒng)中的藥物結(jié)合發(fā)揮作用。通常情況下，循環(huán)中的可溶性靶點或者可脫落靶點含量非常低，含量從pg/mL到ng/mL?？扇苄园悬c會通過快速更新（包括：快速清除，快速產(chǎn)生）維持體內(nèi)較低的基線水平?？扇苄园悬c的表達(dá)水平與疾病密切相關(guān)?？偘悬c水平會在疾病狀態(tài)下上調(diào)；給藥后，由于與藥物結(jié)合，清除率降低，也會提高靶點水平。常見的可溶性配體如TNFα（也存在膜結(jié)合形式）、VEGF、BLyS、IL-1β、IL-12/IL-23、RANKL、IgE、IL-6（也存在膜結(jié)合形式）等。

二、單抗的藥代動力學(xué)特點

單克隆抗體藥物是由抗原結(jié)合域（Fab）和可結(jié)晶區(qū)域（Fc）組成。Fab段由輕鏈和部分重鏈構(gòu)成，主要特異性識別相關(guān)抗原，進(jìn)而調(diào)控下游信號通路；Fc段則由剩余的重鏈部分構(gòu)成，可識別并結(jié)合表達(dá)Fc受體的免疫細(xì)胞(如自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞) 以及補體，以激活相應(yīng)的免疫應(yīng)答，介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用（ADCC）、抗體依賴的細(xì)胞吞噬作用（ADCP）以及補體依賴細(xì)胞毒作用（CDC）等效應(yīng)（如圖2所示）。

圖2 單抗的結(jié)構(gòu)特點[Protn & Cell, 2018]

目前獲批的單抗主要都是IgG亞型，IgG每條鏈包含恒定區(qū)（Constant region，C區(qū)）和可變區(qū)（Variable region，V區(qū)）。恒定區(qū)為靠近C端氨基酸序列相對恒定的結(jié)構(gòu)域；可變區(qū)為輕鏈和重鏈靠近N端的氨基酸序列變化較大的結(jié)構(gòu)域，可變區(qū)決定抗體的抗原特異性。V_H和V_L各有3個氨基酸組成和排列順序高度可變的區(qū)域，這些區(qū)域稱為高變區(qū)(Hypervariable region，HVR)，該區(qū)域形成的與抗原表位互補的空間構(gòu)象，被稱為互補決定區(qū)（Complementary determining region，CDR），與可變區(qū)的其它部分相比，CDR序列可變性更高。

藥代動力學(xué)在小分子藥物研發(fā)中起了極其關(guān)鍵的作用，單抗由于其分子質(zhì)量較大（達(dá)150 kDa），具有親水性、可變的溶解度、膜通透性較差等理化特性，使其呈現(xiàn)出不同于小分子藥物的獨特的藥代特征，如：口服吸收差、皮下/肌肉注射時的淋巴轉(zhuǎn)運、有限的腎排泄、FcγR/FcRn受體介導(dǎo)的體內(nèi)循環(huán)、靶點介導(dǎo)的藥物處置等。下面將介紹單抗的吸收、分布、消除以及藥代動力學(xué)模型。

1 吸收

單抗分子量大、極性較強、具有較低的分配系數(shù)和擴散性能、使其不易為親脂性生物膜攝取，故很難通過胃腸道進(jìn)行吸收。同時，存在于胃腸道大量的酶會對藥物產(chǎn)生降解作用。胃腸粘膜的低通透性和高酶活性這兩方面的屏障作用使其生物利用度十分有限（小于1%-2%），絕大多數(shù)口服后不能產(chǎn)生足夠的藥效濃度。因此，單抗的給藥方式通常采用靜脈注射給藥方式、皮下或肌肉注射給藥。皮下或肌肉注射給藥生物利用度較高，一般在52%-80%范圍。

通常，分子量<16 kDa的藥物可通過毛細(xì)血管進(jìn)入體循環(huán)系統(tǒng)，而目前認(rèn)為皮下或肌肉注射的分子量較大的單抗，主要是在淋巴系統(tǒng)中以對流轉(zhuǎn)運的方式進(jìn)行吸收（如圖3所示），極少部分通過新生兒受體（the Neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）吸收。淋巴系統(tǒng)具多孔性，孔道的截留分子量是單抗分子量的100倍，使得相對分子質(zhì)量較大的單抗能夠在細(xì)胞間液對流作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)運吸收。在淋巴系統(tǒng)中，單抗可被單向運輸至靜脈系統(tǒng)。正常生理情況下，淋巴流動速度較慢（15 mL/天），使得皮下注射給藥需要長至數(shù)小時甚至數(shù)天時間才能被吸收，mAb的達(dá)峰時間為1.7-13.5 d，大多是6-8 d達(dá)到峰濃度。許多因素都會影響皮下注射時單抗的吸收過程，如注射部位，藥物因素如電荷、分子大小、糖基化、制劑類型以及給藥劑量等；還與人的體重、性別、年齡、活動水平、疾病狀態(tài)、呼吸速率以及血壓息息相關(guān)；種屬間淋巴組成的差異還會使藥物的吸收存在種屬差異。

圖3 單抗通過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運[Aging, 2019]

2 分布

對于傳統(tǒng)小分子藥物而言，為了明確可能的毒性代謝產(chǎn)物在組織內(nèi)的積累，研究藥物在全身的分布必不可少。但是，對于單抗藥物，其分解代謝的產(chǎn)物為氨基酸，可在內(nèi)源性氨基酸庫中循環(huán)再利用，因此，單抗的分布研究主要是用來評價藥物對特異組織的靶向作用，以及鑒別主要的消除器官。

單抗的分布依賴于組織內(nèi)的滲透率和在組織間隙的分布能力、在細(xì)胞表面受體的結(jié)合水平、以及從組織清除（包括細(xì)胞內(nèi)攝取和降解）的能力。單抗的滲透（extravasation）主要通過三個過程：被動擴散、對流轉(zhuǎn)運和上皮細(xì)胞的胞吞作用。靶點和藥物的親和力常數(shù)約為1 nM，而一般單抗血藥濃度超過10 nM可以起效。主要受限于單抗的理化特性和分子大小，導(dǎo)致其難以通過擴散的方式分布進(jìn)入組織。單抗通過被動擴散跨過細(xì)胞膜的比例較小，而主要是通過細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運或者跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運分布到外周組織。對流轉(zhuǎn)運是在血液-組織靜水壓梯度驅(qū)動下，藥物通過血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的空隙進(jìn)入組織間隙或者經(jīng)由淋巴系統(tǒng)從間質(zhì)間隙轉(zhuǎn)運至血液。對流屬于細(xì)胞旁路途徑，被認(rèn)為是單抗由血液轉(zhuǎn)運至組織的主要方式，由從血管到組織的體液流量決定?？缂?xì)胞轉(zhuǎn)運途徑主要是通過胞吞作用實現(xiàn)的。胞吞作用包括受體介導(dǎo)的內(nèi)攝作用（如Fcγ受體、FcRn）以及非受體介導(dǎo)的吞噬作用和胞飲作用。由Fc受體介導(dǎo)通過血管上皮細(xì)胞的胞吞作用，可能是單抗另一種重要的轉(zhuǎn)運途徑。尤其在組織中，通過對流作用跨膜受限時，該途徑尤為重要。許多研究表明，該途徑具有雙向轉(zhuǎn)運特性，如進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的抗體在FcRn的作用下，既可以被轉(zhuǎn)運到組織間隙，也可以被重新轉(zhuǎn)運回血管中。單抗的組織分布如圖4所示。

圖4 單抗的組織分布[Journal of Pharmaceutical Sciences, 2004]。a. 通過胞飲攝取進(jìn)入細(xì)胞或者通過FcRn介導(dǎo)回到血液或者轉(zhuǎn)運至組織間隙；b. 藥物通過在血管內(nèi)皮細(xì)胞旁路的對流轉(zhuǎn)運進(jìn)入組織間隙，然后通過淋巴液的對流轉(zhuǎn)運從組織中消除；c. 與靶點抗原結(jié)合。

在組織間隙和細(xì)胞表面，單抗可依靠對流與靶點結(jié)合進(jìn)行分布?？梢?，靶點在血中的單抗，其組織分布會受到限制。單抗從組織間隙清除依賴于單抗進(jìn)入淋巴的對流速率。這個過程與從血管至組織間隙的過程一樣，依賴于梯度差、液體流速（淋巴流速）等。由于淋巴具有相對大的孔徑，單抗從組織間隙到淋巴的過程比從血液滲透至組織間隙時遇到的阻力要小。通常，組織間隙中未結(jié)合的單抗?jié)舛鹊陀谘袧舛取?/span>

藥物在組織中的分布常用表觀分布容積（V_ss）來表示。V_ss為體內(nèi)藥物總量平衡后，按血藥濃度計算所需體液總體積，是通過穩(wěn)態(tài)時體內(nèi)藥物總量與血藥濃度的比值進(jìn)行計算的。藥物在組織中的量是由組織間隙液中的藥物和結(jié)合在細(xì)胞上或者內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)的量決定的。對那些可以與細(xì)胞膜受體結(jié)合的藥物，藥物主要則集中在組織中，V_ss按理應(yīng)該非常大。與此相反，大多報道表明這類藥物的V_ss僅相當(dāng)于血液的體積（哺乳動物60-80 mL/kg）。主要可能由于采用了非房室模型或者房室模型（如二室模型）進(jìn)行計算導(dǎo)致的。同時，由于藥物與靶點結(jié)合有限而呈現(xiàn)非線性分布，V_ss會隨著劑量或者穩(wěn)態(tài)血藥濃度的增加而減小。此外，IgG的組織分布還會受限于細(xì)胞間的基質(zhì)組成。細(xì)胞間隙基質(zhì)具有凝膠樣粘度，并且具有凈負(fù)電荷，組成有粘多糖（如玻尿酸）和膠原蛋白，它們會與IgG分子存在相互排斥作用。

3 消除

抗體通過排泄或分解代謝的方式進(jìn)行消除。腎臟主要分解代謝分子量低于60 kDa的物質(zhì)，所以完整的抗體難以通過腎臟進(jìn)行過濾消除。和免疫球蛋白一樣，單抗主要也是通過分解代謝的方式進(jìn)行消除，得到的肽段和氨基酸可參與內(nèi)源性蛋白質(zhì)的合成。Fab和Fv可以通過腎小球過濾、腎小管重新吸收或代謝。單抗藥物可在細(xì)胞內(nèi)被溶酶體或/和蛋白酶降解成肽段和氨基酸，或者通過與抗原形成免疫復(fù)合物被免疫系統(tǒng)清除。單抗的消除方式有：非特異性的細(xì)胞吞噬作用、非特異性的Fc受體介導(dǎo)的消除和特異性的靶點介導(dǎo)的消除。

3.1 非特異性的細(xì)胞吞噬作用

胞飲是內(nèi)皮細(xì)胞在液相環(huán)境下，對抗體產(chǎn)生非特異性的內(nèi)吞作用。體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞表面積大于1000 m²，其可有效地從體內(nèi)清除IgG。通過胞飲攝取作用分解代謝IgG并非局限于某個器官，而是全身都會發(fā)生。尤其是發(fā)生在那些內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管床內(nèi)。皮膚、肌肉和胃腸道是IgG的主要消除途徑。

3.2 非特異性的Fc受體介導(dǎo)的消除

抗體的Fc可與Fcγ受體（FcγRs）結(jié)合內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞或者通過ADCC作用被清除，F(xiàn)c還可以通過與補體C1q（C_H2）結(jié)合介導(dǎo)CDC作用清除藥物，該途徑具有較大的清除能力，會使藥物呈現(xiàn)線性藥代特點。

FcγRs通常表達(dá)于內(nèi)皮、肌肉、肝等組織的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞表面，有FcγRⅠ，Ⅱ和Ⅲ三種亞型，可識別生物分子Fc區(qū)域（C_H1和C_H2）。通過與FcγRs結(jié)合激活細(xì)胞的內(nèi)吞與水解作用，從而介導(dǎo)生理性抗體的消除。Fc受體不僅可介導(dǎo)生理性IgG的消除，也可以介導(dǎo)具有Fc的外源性治療性蛋白的消除。利用FcγRs敲除的動物研究表明，對大部分單抗，F(xiàn)cγRs介導(dǎo)的清除所發(fā)揮的作用較小。可能由于血中存在大量的生理IgG會增加與相對含量低的單抗藥物競爭結(jié)合FcγRs的機會，從而削弱了藥物與受體的結(jié)合作用，使得FcγRs對單抗的PK影響并不明顯。大部分單抗可通過形成可溶性的免疫復(fù)合物，通過其效應(yīng)功能發(fā)揮藥效作用（如ADCC）的同時，免疫復(fù)合物會增加與FcγRs的結(jié)合能力，此時，通過FcγRs的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用可能會對單抗整體的消除有額外的貢獻(xiàn)。

為了維持體內(nèi)IgG的平衡以發(fā)揮其生理作用，F(xiàn)cRn對IgG的保護(hù)機制較為重要，如圖5所示，該作用與Fcγ受體作用相反。FcRn在內(nèi)皮細(xì)胞，髓樣抗原呈遞細(xì)胞（APCs、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和一些樹突細(xì)胞）、成年人的腸道、血腦屏障、肝、腎等均有表達(dá)。FcRn具有重要的生理調(diào)節(jié)功能，在維持血清中IgG的水平中發(fā)揮重要作用。研究表明，F(xiàn)cRn受體與IgG的Fc區(qū)域（C_H2和C_H3）結(jié)合后，能夠避免被細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解。這種結(jié)合依賴于酸性環(huán)境，生理pH環(huán)境下，F(xiàn)cRn與IgG的親和力較低。藥物通過血管內(nèi)皮細(xì)胞或/和循環(huán)系統(tǒng)中單核細(xì)胞的內(nèi)吞作用（胞飲或者受體介導(dǎo)的內(nèi)吞）使血中的IgG與FcRn結(jié)合，通過形成核內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞。核內(nèi)體的酸性環(huán)境使得IgG與FcRn的親和力增加。一旦結(jié)合，F(xiàn)cRn-IgG復(fù)合物會被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面，在生理pH環(huán)境下，釋放IgG回到血液循環(huán)系統(tǒng)中。核內(nèi)體中未結(jié)合的IgG則會被溶酶體中的蛋白酶降解。IgG單抗藥物及其抗原抗體復(fù)合物也同樣會因為FcRn的保護(hù)作用而延長體內(nèi)的消除半衰期。該保護(hù)作用使得IgG1、IgG2和IgG4的消除半衰期長達(dá)18-21天。IgG3與FcRn的親和力較低，所以半衰期僅為7天。有研究表明，鼠敲除FcRn后，IgG的清除增加10倍。IgG與FcRn相互作用一般認(rèn)為是由Fc決定的，但有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ab臂構(gòu)象的變化會影響FcRn的結(jié)合。此外，IgGs的Fv電荷的分布也會影響與FcRn的結(jié)合能力。在眼部和腦組織FcRn介導(dǎo)的清除作用機制不明。

圖5 FcRn介導(dǎo)的IgG循環(huán)保護(hù)作用[Nature Reviews Immunology, 2007]

盡管存在FcRn的保護(hù)作用，但是由于生理IgG濃度達(dá)12 mg/mL，使得FcRn的再循環(huán)過程飽和，會削弱該作用。當(dāng)IgG的濃度增加，無論是給予高劑量的外源性免疫球蛋白，還是內(nèi)源性變化如多發(fā)性骨髓瘤，IgG的清除率都會增加，半衰期降低。相反，低丙球蛋白血癥患者則會降低單抗的清除，延長半衰期。然而，由于大部分的單抗臨床給藥劑量低于10 mg/kg，僅占人體內(nèi)IgG總量的1%-2%，所以FcRn對IgG的再利用作用一般在給予治療劑量的單抗時不產(chǎn)生明顯改變。此外，藥物與人體的FcRn結(jié)合時，非人源抗體較人源化抗體的親和力低，隨著人源化程度的增加單抗的半衰期顯著地延長，半衰期由小到大依次為：鼠源性<嵌合型<人源化<完全人源化。由于FcRn與人IgG的親和力存在種屬差異，選擇動物模型時需要注意。人IgG1與鼠FcRn的結(jié)合能力是與人FcRn結(jié)合能力的2.5倍，所以在鼠模型上評價人IgG1的FcRn介導(dǎo)的吸收和分布過程時會高估該作用；而人IgG與食蟹猴的FcRn的結(jié)合能力與人相似。

3.3 特異性的靶點介導(dǎo)的消除

單抗具有靶點介導(dǎo)的藥物消除（Target-mediated drug disposition, TMDD）特征，可特異地與細(xì)胞表面的靶點/抗原結(jié)合，通過內(nèi)化作用進(jìn)行消除。細(xì)胞對藥物內(nèi)吞后，可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)溶酶體對單抗-受體復(fù)合物的降解。由于細(xì)胞表面靶點的數(shù)目有限，該途徑易飽和，不僅與藥物的劑量有關(guān)，還與靶受體的生物學(xué)特性，如親和力、表達(dá)水平（上調(diào)/下調(diào)）、內(nèi)化率及更新速率有關(guān)。該途徑的作用程度取決于單抗的暴露量和靶點水平之間的關(guān)系，見圖6。當(dāng)藥物的暴露量遠(yuǎn)小于靶點量時，該消除途徑未達(dá)飽和，總體呈現(xiàn)為線性藥動學(xué)特征。隨著藥物濃度逐漸增加至大于靶點量時，該消除途徑則開始飽和，清除率隨著劑量的增大而降低，呈現(xiàn)出非線性特征。但當(dāng)進(jìn)一步增加藥物的暴露量時，靶點介導(dǎo)的消除作用將遠(yuǎn)小于Fc介導(dǎo)的非特異性消除作用，消除呈現(xiàn)一級動力學(xué)特征，清除率降低，藥時曲線表現(xiàn)為達(dá)到平臺，總體呈現(xiàn)為線性藥代。若體現(xiàn)在給藥劑量上，低劑量時，靶點介導(dǎo)的消除途徑呈現(xiàn)非線性PK，隨著劑量的增加，清除率逐漸降低；隨著靶點的飽和，靶點介導(dǎo)的清除對藥物的整體清除率的貢獻(xiàn)有限，甚至可忽略不計，PK又呈現(xiàn)線性。通過單次靜脈給予藥效相關(guān)動物受試藥物遞增劑量，從清除率或者半衰期與劑量的變化數(shù)據(jù)可以輕易地判斷藥物是否具有TMDD特征。

圖6 藥物TMDD的C-T曲線[Journal of Pharmacokinetics & Pharmacodynamics, 2012](A) 藥物與靶點快速成成平衡; (B) 靶點處于飽和狀態(tài)，藥物主要通過異化作用消除，該過程是一級動力學(xué)過程，所以總體呈現(xiàn)線性PK; (C) 靶點飽和狀態(tài)逐步減弱，此時靶點介導(dǎo)藥物處置的這個消除途徑越來越明顯，呈現(xiàn)非線性PK; (D) 藥物濃度進(jìn)一步降低，靶點遠(yuǎn)未達(dá)飽和，靶點介導(dǎo)的消除和異化作用都為一級動力學(xué)過程，總體又呈現(xiàn)為線性PK。

TMDD一般多見于作用于膜受體的單抗，作用于可溶性配體的單抗也會表現(xiàn)TMDD特征。另外，由于種屬差異，動物的藥效靶點常比人體內(nèi)的活性差，而且一些藥效靶標(biāo)在患者體內(nèi)一般比健康人更多，因此臨床患者更易發(fā)生非線性PK。但通常臨床研究給藥劑量下，TMDD消除途徑飽和使得藥物大都呈現(xiàn)線性特點。單抗的體內(nèi)過程如圖7所示。

圖7 單抗的體內(nèi)過程[Advanced Drug Delivery Reviews, 2013]

4 藥代動力學(xué)模型

4.1 非房室和房室模型

單抗的藥代動力學(xué)模型大都采用房室模型和非房室模型進(jìn)行擬合，尤其以經(jīng)典的二房室模型的應(yīng)用居多。房室模型理論中假設(shè)藥物在各房室間的轉(zhuǎn)運速率以及藥物從中央室中消除的速率均遵循一級反應(yīng)動力學(xué)，因此動力學(xué)過程屬于線性動力學(xué)。房室模型和非房室模型的假設(shè)前提是線性PK，并且藥物在血漿和組織間可快速達(dá)到平衡，而單抗與靶點具有特異性的親和性，呈現(xiàn)非線性動力學(xué)特征，實際中，采用非房室模型或者簡單的房室模型擬合會低估V_ss。

4.2 TMDD模型

TMDD模型用于描述單抗與靶點結(jié)合以單抗-靶點復(fù)合物的形式進(jìn)行消除的特性。該模型需要結(jié)合藥物與靶點的結(jié)合和解離常數(shù)進(jìn)行描述。雖然TMDD有助于了解藥物與靶點之間的相互作用機制，但實際中應(yīng)用較少，除了因為可能缺少靶點和/或藥物靶點復(fù)合物濃度的數(shù)據(jù)，為了識別非線性特點PK數(shù)據(jù)還需要跨越較大的濃度范圍使實驗難度增加。由于藥物靶點結(jié)合速率遠(yuǎn)大于解離速率，加上實際中劑量的選擇、采血點的選取，以及可能存在的免疫原性等因素的影響，使得TMDD模型擬合的數(shù)據(jù)可能有偏差。可以采用快速結(jié)合假設(shè)（RB）、準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)假設(shè)（QSS）和米氏假設(shè)對TMDD模型進(jìn)行簡化，以提高該模型的穩(wěn)定性。

4.3 生理PBPK模型

PBPK模型賦予了房室生理和解剖意義。單抗藥物的PBPK模型可以同時描述血漿藥物動力學(xué)特征、組織藥物濃度與時間的關(guān)系，以及單抗藥物特殊的處置方式，如TMDD、對流轉(zhuǎn)運、FcRn介導(dǎo)的藥物再利用，蛋白酶降解等。一個PBPK模型甚至?xí)?6個組織房室，每個房室還會進(jìn)一步分為血管、核內(nèi)體、細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞的房室，不同種屬參數(shù)不同，不同組織不同系數(shù)，會涉及到藥物與FcRn的結(jié)合和解離常數(shù)、未結(jié)合藥物的降解速率、以及胞飲作用的清除速率等。PBPK模型極為復(fù)雜的建立過程限制了其應(yīng)用。簡化的PBPK模型的出現(xiàn)在一定程度上提高了其適用性。

4.4 PK/PD模型

不像小分子，通常，單抗存在TMDD，使其PK與PD具有較好的相關(guān)性。PK/PD模型有助于預(yù)測藥物在人體的安全性和有效性，有助于了解抗體和靶點的相互作用機制，有助于理解潛在的生物學(xué)功能和疾病發(fā)展進(jìn)程間的關(guān)系。已有許多研究基于單抗不同的應(yīng)用建立相應(yīng)的PK/PD模型，如免疫毒性治療、靶細(xì)胞消除、改變細(xì)胞功能及靶向藥物等。根據(jù)靶點對藥物的處置特點以及藥物與靶點的相互作用特點建立合適的PK/PD模型對于單抗藥物的研發(fā)具有重要意義。

三、影響單抗藥物代謝的因素

1 藥物特性對PK的影響

1.1 電荷

蛋白所帶電荷為零時的pH為等電點（Isoeletric point，PI），此時蛋白質(zhì)在電廠中的遷移率為零，可用來衡量蛋白的帶電性。在與細(xì)胞表面的具有負(fù)電性的靶點相互作用時，單抗的帶電性會影響PK。一般說來，單抗的PI越高，偏堿性，表現(xiàn)出易與細(xì)胞表面的負(fù)電性位點相結(jié)合，則組織攝取率增加，清除率加快；相反，PI越低，偏酸性，由于細(xì)胞表面結(jié)合位點負(fù)電性的互斥作用，使得細(xì)胞攝取較低，表現(xiàn)出組織攝取和血中清除率的降低。研究發(fā)現(xiàn)，藥物的PI值改變至少1個單位時才對其PK和組織分布產(chǎn)生影響，若改變不足1，一般不會影響PK。同時，通過PI的改變可以優(yōu)化藥物的PK特性，尤其對于那些具有較強的靶點介導(dǎo)清除特征的藥物，可通過降低藥物的PI，降低藥物的清除，延長半衰期。

1.2 糖基化類型

和天然IgG一樣，目前獲批的單抗大部分都具有糖基化位點（C_H2，Asn297），有的藥物Fab區(qū)還會有糖基化位點。位于C_H2區(qū)域Asn297上糖基化側(cè)鏈在調(diào)控單抗與C1q和FcγRs的結(jié)合作用中起著關(guān)鍵的作用。在抗體介導(dǎo)的CDC效應(yīng)功能中，通過Fc與補體C1q結(jié)合啟動補體級聯(lián)反應(yīng)致使靶細(xì)胞裂解；在抗體介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)功能中，抗體的Fc與效應(yīng)細(xì)胞上的FcγRs結(jié)合引起單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或者NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用。

不同的糖基化類型對PK和PD會有不同的影響，比如通過糖基化的改變可增加藥物與FcγRIIIa的結(jié)合以增強ADCC效應(yīng)，增加了殺傷靶細(xì)胞的同時加快了藥物的消除。有研究還發(fā)現(xiàn)，糖基化側(cè)鏈上無半乳糖結(jié)構(gòu)的IgG2和IgG1（可能）在體循環(huán)中的半衰期會較其它形式的長20%-40%，可能的原因是半乳糖基化形式與FcγRI的親和力更高。

2 可溶性/可脫落靶點對PK的影響

2.1 可溶性靶點

體內(nèi)靶點水平的高低會使單抗的PK呈現(xiàn)不同的特點，作用于可溶性靶點的單抗的PK特點如表1所示。

單抗直接作用于體內(nèi)水平較低的可溶性配體時，如：TNFα、干擾素-α、VEGF和IL-5，會表現(xiàn)出線性消除的特點。免疫復(fù)合物通過FcγRs清除會呈現(xiàn)非特異性、線性消除的特點。在大多數(shù)情況下，游離的可溶性配體的清除過程較免疫復(fù)合物快?？扇苄园悬c與單抗藥物結(jié)合后，由于可溶性配體會遵循單抗的分布和清除規(guī)律，同時，藥物可能會阻礙可溶性配體正常的消除過程使其在循環(huán)系統(tǒng)中積累，所以血漿中總靶點水平會顯著升高；同時，藥物的結(jié)合使可溶性靶點水平降低，這種負(fù)反饋機制也可使機體增加對這些靶點的合成。此外，作用于低水平可溶性靶點單抗藥物的PK不會因為患者靶點水平的上調(diào)而發(fā)生變化。

單抗作用于體內(nèi)水平較高的靶點時，如IgE、RANKL（Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand），藥物呈非線性動力學(xué)特征，并且藥物與配體結(jié)合后會表現(xiàn)出更快的清除免疫復(fù)合物的現(xiàn)象。可能的原因有：對于像TNF和TGF超家族的細(xì)胞因子等這些天然的二聚體或者三聚體游離配體，可組成多個重復(fù)的表位結(jié)合多個藥物；并且更易于聚集，可以與藥物形成超大免疫復(fù)合物，進(jìn)而增強FcγRs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如ADCC效應(yīng)、吞噬作用以及炎癥反應(yīng)，通過細(xì)胞吞噬的作用快速地清除藥物。

表1 靶向內(nèi)源性可溶性配體的單抗的PK特點

來源：Expert Review of Clinical Pharmacology, 2016

2.2 可脫落靶點

相比于與血管外的膜靶點結(jié)合，單抗更易與脫落的靶點結(jié)合聚集在血管區(qū)域，作用于可脫落靶點的單抗的PK呈現(xiàn)非線性，如表2所示。非線性PK可能是TMDD或時間依賴的消除機制引起的。藥物同時提高可溶性配體和細(xì)胞表面受體的水平時，可能會導(dǎo)致TMDD。時間依賴性消除與靶點的耗竭（depletion）或者靶點表達(dá)水平隨時間變化有關(guān)。循環(huán)中脫落的靶點可與藥物結(jié)合形成免疫復(fù)合物，可以加速免疫復(fù)合物清除的同時，還會干擾藥物與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而影響藥物的療效。此外，脫落抗原水平、藥物與脫落靶點和膜靶點的相對結(jié)合動力學(xué)的差異會影響膜靶點的RO?？梢?，脫落靶點對藥物PK和PD均有影響。

表2 靶向膜結(jié)合可脫落靶點單抗的PK特點

來源：Expert Review of Clinical Pharmacology, 2016

3 患者因素對PK的影響

患者的基因多態(tài)性、疾病狀態(tài)等均會對藥物PK產(chǎn)生影響。例如患者的FcRn異源二聚體的表達(dá)差異會對單抗的藥代有影響。常見的VNTR3/VNTR3基因型對FcRn的轉(zhuǎn)錄水平是VNTR3/VNTR2的1.66倍，使得infliximab在雜合子腸炎患者體內(nèi)比純合子患者體內(nèi)的暴露低。另外，F(xiàn)cγR也存在基因多態(tài)性。乳腺癌患者HER2過表達(dá)的患者會存在FcγR IIIa的158位置的苯丙氨酸（F）變成纈氨酸（V）的情況，而氨基酸的變化增強了IgG1與FcγR的親和力，同時增強了ADCC作用。臨床上，V/V基因型的患者對藥物表現(xiàn)出更高的應(yīng)答率。FcγR的基因多態(tài)性會影響以ADCC作用為主要消除途徑時藥物的清除率，如FcγR IIIa為F/F基因型的患者，infliximab體內(nèi)清除率會降低。

患者的疾病狀態(tài)也會影響藥物的藥代。蛋白的分解代謝是單抗的主要消除方式，它會受各種疾病狀態(tài)影響，如癌癥、損傷、慢性炎癥等。體重減輕、體型消瘦等癌癥相關(guān)癥狀是慢性炎性反應(yīng)的表現(xiàn)。癌癥患者相比正常人，炎癥水平的提高會使整體蛋白周轉(zhuǎn)率提高50%-70%，這不僅會影響內(nèi)源性蛋白的代謝，還會影響外源物的代謝。結(jié)果表現(xiàn)為，患者間的非特異性的蛋白清除各不相同。蛋白周轉(zhuǎn)率的增加，如低白蛋白血癥，會導(dǎo)致IgG分解代謝增加，清除率增加，降低藥物的系統(tǒng)暴露。C反應(yīng)蛋白（CRP）是系統(tǒng)炎癥水平升高的一個非特異性指標(biāo)，它在單抗的清除中也較為重要，CRP的體內(nèi)水平與單抗的清除率正相關(guān)。此外，有些腫瘤患者內(nèi)源性蛋白的周轉(zhuǎn)具有時間依賴性，可能由于系統(tǒng)炎性水平的降低，藥物清除率降低，提供了患者對藥物的應(yīng)答。

4 免疫原性對PK的影響

單抗進(jìn)入機體后可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，以進(jìn)入體內(nèi)的抗體作為抗原生成第二抗體，即抗藥抗體（ADA）。ADA的生成可能會加快藥物的消除速率。免疫原性與抗體的人源化程度、給藥方式、給藥劑量、給藥頻次、治療時間的長短有關(guān)。隨著人源化程度的增加，抗體藥物免疫原反應(yīng)發(fā)生概率逐漸減少，但即使是全人源化的單抗也會引起免疫原性；免疫原性的發(fā)生率為皮下注射＞肌肉注射＞靜脈，低劑量、多次、長期給藥易產(chǎn)生免疫原性。此外，免疫原性還與患者的疾病狀態(tài)有關(guān)。

具有中和活性的ADA會影響抗原-抗體結(jié)合，在臨床上會降低藥物發(fā)揮作用，還可能會引起副作用。無論是非中和活性還是中和活性的ADA均可能會對藥物的PK和系統(tǒng)暴露產(chǎn)生影響。對PK產(chǎn)生的影響通常表現(xiàn)為藥物清除率增加，藥物的系統(tǒng)暴露降低或者變化甚微。清除率增加的原因可能是由于大小和結(jié)構(gòu)上各不相同的ADA-單抗復(fù)合物的形成，觸發(fā)了網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中溶酶體對免疫復(fù)合物的攝取和降解，免疫復(fù)合物的消除或快或慢于藥物單獨存在時的消除速率。

5 脫靶效應(yīng)對PK的影響

為了避免自身免疫性疾病，通過體細(xì)胞突變而成熟的抗體會嚴(yán)格控制清除體內(nèi)不利的突變體，這些突變體會非特異性地與自身抗原結(jié)合或廣泛地與正常組織發(fā)生相互作用。盡管單抗的設(shè)計是針對抗原的，然而，體外篩選或者成熟的抗體缺乏體內(nèi)類似的控制系統(tǒng)，會篩選出一些非特異結(jié)合的突變體，對非相關(guān)抗原具有多特異結(jié)合能力。單抗的脫靶效應(yīng)會明顯影響PK、組織分布、藥效以及毒性?？赡軙铀偎幬锏那宄档童熜Щ蛘叻前邢蚪Y(jié)合而引起毒性。

四、單抗藥物生物分析

獲批單抗主要為IgG類型，IgG具有兩個抗原結(jié)合價。給予人或動物單抗藥物后，它可以與循環(huán)中的靶蛋白、抗藥抗體以及其它的內(nèi)源性物質(zhì)相結(jié)合。二價抗體藥物在體內(nèi)有多種可能的存在形式：游離型抗體（mAb_free）、部分游離型抗體（Partial free mAb）、結(jié)合型抗體(mAb_bound)，三者之和為總抗體（mAb_total）。游離型抗體是二價均未結(jié)合配體，也有將游離型抗體定義為二價均未結(jié)合和單價結(jié)合配體的總和；部分游離型是只有單價結(jié)合了配體；結(jié)合型抗體是二價均與配體相結(jié)合；總抗體則是游離型抗體和結(jié)合型抗體的總和（mAb_free+ mAb_bound）。大多數(shù)情況下，由于游離型抗體和部分游離型抗體仍存在與靶點結(jié)合的能力，所以被認(rèn)為是可發(fā)揮藥效作用的活性形式，兩者共存時會與藥物的體內(nèi)暴露、靶點募集（Target engagement）和生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。總藥物濃度可以提供藥物和靶點的相互作用信息。上述藥物形式的體內(nèi)水平會因為PD、免疫原性以及疾病狀態(tài)而隨著時間而變化。所以所選擇的平臺和方法的選擇性、專屬性等尤為重要。

圖8 游離藥物濃度和總藥物濃度檢測示意圖[Bioanalysis, 2014]

根據(jù)不同的實驗設(shè)計、試劑的選擇以及不同的實驗條件，可以采用配體結(jié)合法（LBA）測定上述單抗藥物的不同形式，如圖8所示。LBA法具有特異性高、通量高、靈敏度高等優(yōu)勢，應(yīng)用廣泛，據(jù)統(tǒng)計，臨床95%的生物技術(shù)藥物的PK研究采用的都是LBA法。LC-MS方法作為LBA法的補充（如圖9），在單抗PK研究中的應(yīng)用逐漸引起業(yè)內(nèi)的關(guān)注，尤其臨床聯(lián)用藥物時，試劑不易獲得時，LC-MS可以用于同時定量不同藥物的濃度。

此外，研究靶部位藥物暴露時，由于基質(zhì)復(fù)雜，需要優(yōu)化劇烈的樣品制備方法釋放藥物時，LC-MS較強的專屬性和抗干擾能力可以實現(xiàn)靶部位藥物的準(zhǔn)確定量。平臺的選擇關(guān)乎結(jié)果的可靠性。一般來說檢測游離型藥物濃度首選LBA法，如果需要檢測藥物的總濃度，可以根據(jù)試劑的準(zhǔn)備等因素選擇LBA或者LC-MS。靶點的干擾在分析檢測中不容忽視，無脫落的膜結(jié)合靶點干擾單抗藥物定量的情況少有出現(xiàn)，而對于那些循環(huán)中具有高水平的靶點存在時，則會干擾LBA法檢測的藥物濃度。尤其對于游離型抗體和部分游離型抗體的檢測影響更大。但實際臨床給藥劑量達(dá)到摩爾級別時，可能對藥物定量的影響甚微。

圖9 根據(jù)檢測對象選擇檢測平臺工作流程圖[Bioanalysis, 2014]

五、結(jié)語

在過去的20年里，單抗藥物的研發(fā)取得了史無前例的巨大成就。隨著新型抗體藥物的不斷出現(xiàn)，需要對單抗的處置特點和代謝機制進(jìn)行深入研究，以更好地應(yīng)用于藥物設(shè)計、指導(dǎo)臨床用藥，加快單抗藥物的研發(fā)進(jìn)程。

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