治療性單克隆抗體已成為治療自身免疫性疾病，炎性疾病和癌癥的分子選擇。此外，能夠靶向靶細(xì)胞上超過(guò)一種抗原表位或向靶細(xì)胞募集效應(yīng)細(xì)胞（T細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞或巨噬細(xì)胞）的雙特異性/多特異性抗體在最大化抗體治療上顯示出巨大潛力。在過(guò)去的十年中，許多用于產(chǎn)生雙特異性和多特異性抗體的新穎概念已經(jīng)成功地演變成從完整的雙特異性免疫球蛋白球體到抗體片段的一系列形式。令人印象深刻的是，雙特異性T細(xì)胞銜接子，雙特異性殺傷細(xì)胞銜接子，三特異性殺傷細(xì)胞銜接子，串聯(lián)雙鏈體和雙重親和重靶向等抗體片段在招募和激活自我免疫效應(yīng)細(xì)胞靶向和裂解腫瘤細(xì)胞方面顯示出令人興奮的結(jié)果。有希望的是，可結(jié)晶的片段（Fc）抗原結(jié)合片段和單體抗體或半抗體可能特別有利于靶向?qū)嶓w腫瘤，因?yàn)樗鼈兂叽缧?，因此具有良好的組織穿透潛力，而另一方面保持了Fc相關(guān)的效應(yīng)子功能，例如抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性，補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性，抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用，以及通過(guò)與新生Fc受體相互作用延長(zhǎng)血清半衰期。因此，這篇綜述重點(diǎn)介紹了Fc工程在雙特異性分子產(chǎn)生中的應(yīng)用以及小分子抗體片段作為支架在治療中的應(yīng)用。

自1992年美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)第一個(gè)治療性單克隆抗體（mAb）muromonab-CD3用于治療與器官移植相關(guān)的急性排斥反應(yīng)以來(lái)，截至2016年5月，共有62個(gè)單克隆抗體被USFDA批準(zhǔn)用于臨床使。因此，過(guò)去25年，USFDA每年平均批準(zhǔn)兩到三個(gè)單克隆抗體。令人驚訝的是，在2015年，共有10個(gè)單克隆抗體被批準(zhǔn)。顯然，抗體分子和全球銷(xiāo)售的需求一直在快速上升。

大多數(shù)治療性mAb是完整的免疫球蛋白γ（IgG）分子，其由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈折疊成復(fù)合的四元Y型結(jié)構(gòu)。Y形分子的兩個(gè)臂形成被稱(chēng)為抗原結(jié)合片段（Fab）的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和莖形成可結(jié)晶片段（Fc）區(qū)域。天然IgG分子可以被木瓜蛋白酶消化成單獨(dú)的F（ab）2二聚體和Fc結(jié)構(gòu)域。Fab臂負(fù)責(zé)抗原結(jié)合，并已被廣泛用于開(kāi)發(fā)針對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的高度特異性合成抗體。Fc區(qū)帶有與天然免疫受體[Fcγ受體（FcγRs），C1q和新生Fc受體（FcRn）]結(jié)合的識(shí)別基序，因此負(fù)責(zé)介導(dǎo)免疫效應(yīng)功能和體內(nèi)IgG穩(wěn)定性。這部分主要分子工程學(xué)目標(biāo)是增強(qiáng)或抑制，包括抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性（ADCC），補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性（CDC）和抗體依賴(lài)性的細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ADCP）。除了Fab之外，抗原結(jié)合特征也被改造到Fc，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。這種新穎的片段在早期的研究中已經(jīng)被證明了具有治療效果治療，并且是有吸引力的冒險(xiǎn)。

通過(guò)設(shè)計(jì)更多的特異性，可以使抗體分子更有效，從而可以靶向存在于細(xì)胞上的多種抗原或表位。在過(guò)去的十年中，大量的學(xué)術(shù)和工業(yè)研究集中在開(kāi)發(fā)雙特異性Abs和Igs（bsAbs和bsIgs）和多特異性抗體（例如TriMabs）。

最初，bsAbs由四聯(lián)體技術(shù)產(chǎn)生，這需要具有不同特異性的兩種雜交瘤的體細(xì)胞融合。這是抗體生產(chǎn)的基礎(chǔ)，同時(shí)靶向細(xì)胞上的兩種不同的抗原或表位（圖1A）。然而，這些分子產(chǎn)量低，異質(zhì)性和人抗小鼠抗體（HAMA）反應(yīng)低，患者的療效降低。盡管如此，2009年，歐洲藥品管理局（European Medicines Agency）批準(zhǔn)bsAb EpCAM×CD3（triomab; catumaxomab）用于治療上皮癌相關(guān)惡性腹水患者。使用四聯(lián)瘤方法產(chǎn)生的另外兩種bsAb，HER2xCD3（triomab; ertumaxomab）和CD20xCD3（trioγbb; FBTA05），正在臨床試驗(yàn)中評(píng)估中。

后來(lái)，bsAb構(gòu)建主要依賴(lài)于Fc雜化，通過(guò)在CH3結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生“突變孔”（KiH）突變，這是組裝兩種半抗體（共同的Fc異源二聚體和獨(dú)特的VH-CH和VL-CL）的先決條件。然而，這一戰(zhàn)略的一個(gè)主要瓶頸是輕重鏈的配對(duì)不正確。因此，基于KiH和其他平臺(tái)的更新策略已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)以規(guī)避有缺陷的重鏈和輕鏈配對(duì)。

來(lái)自于美洲駝和駱駝免疫系統(tǒng)的小的抗體片段，單個(gè)的人源結(jié)構(gòu)域抗體和單鏈可變片段（scFv）的小抗體片段可以賦予抗體分子雙特異性或多特異性。此外，小的非免疫球蛋白片段如單克隆螢火蟲(chóng)抗體（lambody），親和體和DNA / RNA適體可與抗體Fc片段（同源二聚化或異二聚化）融合以具有抗體樣性質(zhì)，例如Fc相關(guān)效應(yīng)子功能（ADCC，CDC和ADCP ），擴(kuò)展的藥代動(dòng)力學(xué)和雙特異性。

在這篇綜述中，我們描述了雙特異性分子和小Ab片段作為新型支架的治療潛力的最新進(jìn)展。 總結(jié)采用和優(yōu)化各項(xiàng)戰(zhàn)略取得的重大突破?？偨Y(jié)最終雙特異性分子的代表性設(shè)計(jì)，表達(dá)，純化和純度（見(jiàn)表1）。列出了目前臨床評(píng)估中的一些雙特異性抗體和抗體片段（見(jiàn)表2），并展示了正在開(kāi)發(fā)的雙特異性分子的圖形模型（參見(jiàn)圖1）。

KiH概念在異二聚體中錯(cuò)配了重鏈和輕鏈。Merchant等人建議對(duì)兩個(gè)Fab結(jié)構(gòu)域使用相同的輕鏈，這可以通過(guò)工程化的二硫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定（圖1C）。他們使用具有限制輕鏈?zhǔn)褂玫膕cFv噬菌體展示文庫(kù)來(lái)鑒定識(shí)別使用相同輕鏈的c-MPL和HER3的抗體，并開(kāi)發(fā)了雙特異性cMPL×HER3抗體，其具有約95％的異源二聚體。

但是，不可能總是使用相同的輕鏈開(kāi)發(fā)雙特異性分子，因?yàn)榭乖R(shí)別嚴(yán)格依賴(lài)的鏈。 了克服bsIgs中現(xiàn)有的輕鏈錯(cuò)配問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了一種名為“CrossMab”的方法，并將其與KiH技術(shù)相結(jié)合。 則上，通過(guò)交換一個(gè)臂上的Fab部分的重鏈和輕鏈以實(shí)現(xiàn)“CrossMab Fab”（圖1D），“CrossMab VH-VL”（圖1E）或 “CrossMab CH1-CL”（圖1F）。這種雙特異性格式很清楚減少重鏈輕鏈錯(cuò)配，允許兩種抗原（VEGF-A和Ang2）的同時(shí)識(shí)別，保留了親本抗體的親和力和穩(wěn)定性譜，并在體內(nèi)表現(xiàn)出抗血管生成和抗腫瘤活性。

類(lèi)似地，開(kāi)發(fā)了三特異性抗體“TriMabs”（圖1G），并使用N端單鏈Fab（scFab）和Fc區(qū)的C端scFv融合物（其避免輕鏈錯(cuò)配）與KiH技術(shù)組合。該概念通過(guò)使用四種特異性（EGFR，IGFR，cMET和HER3）被并入三種結(jié)構(gòu)形式中來(lái)證明。TriMab 1和2以單價(jià)方式與它們各自的抗原結(jié)合，而TriMab 3以二價(jià)方式結(jié)合HER3。這些分子保留了結(jié)合單個(gè)抗原的能力與其母體分子共享動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。此外，還顯示TriMabs在固定在芯片上或在人類(lèi)胰腺癌細(xì)胞（BXPC-3）上表達(dá)時(shí)同時(shí)識(shí)別它們各自的抗原并抑制受體信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤生長(zhǎng)。

還描述了具有抗IGF1R和抗EGFR特異性的scFab異二聚體bsIg格式（OAscFab-IgG）（圖1H），以防止錯(cuò)配的鏈配對(duì)。scFab形式的輕鏈通過(guò)32殘基接頭連接到重鏈的N端，并且通過(guò)KiH突變實(shí)現(xiàn)異二聚體形成。該策略能夠回收99％純的異源二聚體，其對(duì)親本抗體顯示出比較性抗原結(jié)合親和力。

此外，有的功能被設(shè)計(jì)在依賴(lài)于蛋白水解切割以產(chǎn)生功能性結(jié)合物的雙特異性分子中。分別摻入C44或C100突變的VH和VL結(jié)構(gòu)域分別通過(guò)柔性接頭附著至突變體和突變體中的Fc區(qū)的C-末端。VH C44和VL C100產(chǎn)生二硫鍵穩(wěn)定化的Fv（圖1I），繞過(guò)了VH-VL連接體的需要，以促進(jìn)這種排列中的異二聚體形成。在這里，C-末端附著不影響解離速率，而是在蛋白水解切割之后減輕空間位阻。這個(gè)方法可以用于在細(xì)胞中以無(wú)活性狀態(tài)表達(dá)有毒產(chǎn)物，在處理步驟中可以通過(guò)蛋白水解切割再稍后活化。該設(shè)計(jì)在其中一條合作鏈上的肽接頭中包含了預(yù)裂解的蛋白水解基序。其他蛋白水解系統(tǒng)如弗林蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶-2 / 9或尿血纖溶酶原激活物的識(shí)別基序也可以設(shè)計(jì)用于各種應(yīng)用。

接下來(lái)，使用結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的方法來(lái)生成bsIg，通過(guò)在大腸桿菌中分別表達(dá)單體IgG（帶有KiH突變）。當(dāng)在堿性pH下混合時(shí)，等摩爾量的兩種單體IgG主要產(chǎn)生異源碘化IgG。這些構(gòu)建體也在CH2結(jié)構(gòu)域殘基（F241R / F243S或F241S / F243R）中引入突變，其在非糖基化IgG分子和鉸鏈區(qū)（C226S / C229S）中保持溶劑暴露，以避免旋鈕/旋鈕或空穴/空穴單體的共價(jià)結(jié)合。

最近，徐等人利用無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生成基于KiH格式的bsIg。他們使用抗CD3，抗EpCAM和抗HER2抗體在四種不同的KiH支架中產(chǎn)生八種bsIg。在這些支架中，scFv-KiH和scFv-KiHr（反向）表現(xiàn)出優(yōu)異的產(chǎn)量。此外，該系統(tǒng)通過(guò)使用等摩爾質(zhì)粒比率和不顯著量的游離鏈允許最佳異二聚體表達(dá)。發(fā)現(xiàn)具有孔的Fc片段比Fc結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，并且建議將難表達(dá)的蛋白質(zhì)融合到Fc-孔以高水平表達(dá)。

使用KiH平臺(tái)，Mazor等人在Fab臂之一的CH1-CL界面中引入了兩個(gè)半胱氨酸對(duì)，以產(chǎn)生用于正確輕鏈配對(duì)的二硫鍵。從CH1（F126C）和CL（S121C）突變的變體中回收幾乎100％的單價(jià)bsIg。應(yīng)用這些突變構(gòu)建EGFR×HER2和CD4×CD70“DuetMabs”（圖1J）（52）并顯示沒(méi)有任何游離鏈或片段，并具有與天然IgG類(lèi)似的分子量。EGFR×HER2（Tm = 55℃）和CD4×CD70（Tm = 58℃）抗體的熱穩(wěn)定性與親本抗體相當(dāng)。DuetMabs可以同時(shí)參與，因此CD4×CD70 DuetMab優(yōu)先識(shí)別CD4 + CD70-或CD4-CD70 + T細(xì)胞上的CD4 + CD70 + T細(xì)胞。類(lèi)似地，EGFR×HER2分子與親本抗體共有結(jié)合動(dòng)力學(xué)，并與FcγR，C1q和FcRn正常結(jié)合。

基于涉及分子建模，X射線晶體學(xué)驗(yàn)證和迭代輪的多態(tài)設(shè)計(jì)，Lewis和同事在VH-VL和CH1-CL的界面上鑒定了幾個(gè)有利的突變體，以形成正交Fab界面。結(jié)合以前報(bào)道的有利于Fc異二聚化的Fc突變，五個(gè)bsIg從六個(gè)親本mAb正確組裝，平均成功率為93％。最近，Leaver-Fay和同事通過(guò)蛋白質(zhì)對(duì)接和序列設(shè)計(jì)在CH3接口上構(gòu)建了一個(gè)負(fù)狀態(tài)池，進(jìn)一步推進(jìn)了多態(tài)設(shè)計(jì)策略。發(fā)現(xiàn)幾個(gè)新的突變體有利于形成具有超過(guò)90％純度的Fc異二聚化。與正交Fab接口相結(jié)合，可以正確地形成4個(gè)完全bsIgs，一步法平均成功率在93％以上。

CH1-CK異源二聚體支架可用于構(gòu)建雙特異性分子。然而，已知單獨(dú)的CH1-CK對(duì)不足以形成穩(wěn)定的異源二聚體，并且CH1-CK對(duì)需要來(lái)自VH-VL對(duì)的配合才能形成穩(wěn)定的異源二聚體組裝。為了改善不存在VH-VL時(shí)CH1-CK異源二聚化，Chen等人采用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與噬菌體展示定向進(jìn)化相結(jié)合。他們發(fā)現(xiàn)CH1結(jié)構(gòu)域中的S66V突變和CK結(jié)構(gòu)域中的S69L可以穩(wěn)定CH1-CK異二聚化并增加先前描述的CD4抗體融合蛋白（4Dm2m）的體內(nèi)血清半衰期，其靶向人類(lèi)免疫缺陷病毒的CD4誘導(dǎo)的（CD4i）共同受體結(jié)合位點(diǎn)（HIV）1包膜糖蛋白120。似乎這種CH1-CK穩(wěn)定化可能會(huì)增加4Dm2m的整體穩(wěn)定性，從而改善其藥代動(dòng)力學(xué)。此外，強(qiáng)化的CH1-CK異源二聚化可能為基于這種支架的雙特異性分子的構(gòu)建鋪平道路。

一種結(jié)構(gòu)和序列指導(dǎo)的方法確定了低能量CH3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸對(duì)，可以促進(jìn)異源二聚體的形成。這些突變被設(shè)計(jì)到一個(gè)新的文庫(kù)，這增加異二聚體產(chǎn)量高達(dá)89％。該策略應(yīng)用于Fc/單鏈Fv-Fc融合（scFv-Fc）或scFv-Fc形式，利用兩個(gè)有利于異二聚體形成的不同CH3結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生CD16×HER2雙特異性，其表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗乳腺癌特性，癌細(xì)胞系SKBr3來(lái)自人CD16 +天然殺傷（NK）細(xì)胞存在下的外周血單核細(xì)胞（PBMC）的。

在另一種方法中，Strop等通過(guò)鏈配對(duì)的氧化/還原方法開(kāi)發(fā)了雙特異性IgG1和IgG2抗體。他們描述了CH3結(jié)構(gòu)域中的雙特異性突變（K409和L368），其允許通過(guò)共表達(dá)攜帶普通輕鏈的單體或通過(guò)在溫和的還原條件下混合純化的單體來(lái)開(kāi)發(fā)bsIg。通過(guò)用IgG1-鉸鏈或IgG2-鉸鏈突變互補(bǔ)K409/L368獲得最高的雙特異性。如此產(chǎn)生的CD3xCD20bslg，在新分離的小鼠原代T細(xì)胞的存在下針對(duì)小鼠B細(xì)胞淋巴瘤，顯示體外細(xì)胞毒性。此外，bsIg介導(dǎo)靶細(xì)胞的劑量依賴(lài)性裂解，并且還通過(guò)T細(xì)胞接合在體內(nèi)耗盡CD20 + B細(xì)胞。

Labrijn等人應(yīng)用了類(lèi)似的產(chǎn)生IgG1雙特異性分子的概念。它們引入了P228S鉸鏈突變，使得鍵在還原條件下更易于切割，并且在單獨(dú)的人IgG1-CH3結(jié)構(gòu)域中進(jìn)一步突變以促進(jìn)Fab臂交換。兩種IgG1形式的突變抗體（抗EGFR和抗CD20）分開(kāi)表達(dá)，然后在還原劑存在下混合在一起，導(dǎo)致96％的Fab臂交換（圖1K）。這樣產(chǎn)生的雙特異性分子，在5℃下穩(wěn)定6個(gè)月，并具有與其親本抗體相當(dāng)?shù)乃幋鷦?dòng)力學(xué)。還構(gòu)建了雙重靶向CD3×HER2雙特異性IgG1，與對(duì)照抗體相比，在對(duì)胃癌過(guò)繼轉(zhuǎn)移異種移植模型的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制中，T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)乳腺癌細(xì)胞（AU565）的細(xì)胞毒性與新鮮制備的人類(lèi)PBMCs顯著增強(qiáng)。

此外，結(jié)構(gòu)引導(dǎo)設(shè)計(jì)輔助計(jì)算算法和合作鏈之間優(yōu)化的能量函數(shù)被用來(lái)改善bsIg分子的生物物理特性。與野生型Fc相比，鑒定到有利于純異二聚體形成（95％）和穩(wěn)定性的突變[ZW1-鏈A（T350V / L351Y / F405A / Y407V）和鏈B（T350V / T366L / K393L / T394W）]應(yīng)用于創(chuàng)建雙特異性分子。這些突變大大提高了當(dāng)暴露于熱，酸，堿，攪拌，氧化，凍融和變化的pH時(shí)，異二聚體的穩(wěn)定性。

當(dāng)在同一細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，靜電相互作用也被優(yōu)化用于重鏈和其同源輕鏈的正確配對(duì)。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，通過(guò)用帶電荷的氨基酸替代CH1-CL和VH-VL界面的極性或疏水性殘基來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的突變。由于H鍵和范德華力的靜電相互作用的最大化，這些突變促進(jìn)了重鏈和輕鏈的正確配對(duì)。HER2×EGFR bsIg誘導(dǎo)比親本抗體組合所獲得的更大的受體內(nèi)化，并且在異種移植模型中的腫瘤顯示出增強(qiáng)的抑制BXPC-3，PANC-1和Calu-3的能力。

Davis等人利用IgG和IgA的CH3結(jié)構(gòu)域中的序列多樣性（人類(lèi)中?47％多樣化），提出如果IgG和IgA CH3結(jié)構(gòu)域的不同斑塊相互替代，則它們可以異源二聚化。該策略導(dǎo)致了CH3-CH3界面之間的獨(dú)特互補(bǔ)性。通過(guò)構(gòu)建優(yōu)先結(jié)合異二聚體（85-95％）的鏈交換工程化結(jié)構(gòu)域體（SEEDbody）融合蛋白[IgG1-鉸鏈-CH2-（SEED-IgA-CH3）]來(lái)實(shí)驗(yàn)證明。取決于修補(bǔ)程序序列，這些分子被稱(chēng)為AG或GA SEED。此外，由于從IgG引入IgA中的特定基序，新穎的SEEDbodies（圖1M）保持正常的FcRn和蛋白A結(jié)合。SEED體的主要優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)與SEED體的N末端融合的scFv來(lái)設(shè)計(jì)額外的特異性，其克服了錯(cuò)誤的輕鏈配對(duì)。

通過(guò)bsAbs的化學(xué)優(yōu)化，抗體支架也被用于開(kāi)發(fā)雙特異性藥效團(tuán)“COVX-Bodies”。這里所涉及的原理是通過(guò)分支的氮雜環(huán)丁酮連接子化學(xué)連接兩個(gè)藥效團(tuán)肽，然后通過(guò)不可逆的位點(diǎn)特異性共價(jià)鍵融合到支架抗體上。氮雜環(huán)丁酮連接體與Ig重鏈的K94相互作用并與抗體建立酰胺鍵。例如，人源化的IgG1κ醛縮酶抗體已被用作抗VEGF和抗Ang2肽藥效團(tuán)的單價(jià)展示以開(kāi)發(fā)單價(jià)雙特異性COVX-241的支架。雙特異性COVX-241抑制VEGF-VEGFR2 / Ang2-Tie2相互作用，并進(jìn)一步顯示，與單特異性COVX-體相比，抗結(jié)腸腺癌異種移植模型的功效提高。

Wranik等人提出了另一種開(kāi)發(fā)bsAbs的方法，該方法使用普通的輕鏈和亮氨酸拉鏈（LUZ-Y）（圖1N）。他們通過(guò)在重鏈C末端產(chǎn)生點(diǎn)突變和亮氨酸拉鏈進(jìn)行異源二聚體裝配。此外，如果用于通過(guò)CH3結(jié)構(gòu)域的C-末端賴(lài)氨酸除去亮氨酸拉鏈，則在鉸鏈區(qū)中進(jìn)行K222A取代以避免Lys-C內(nèi)肽酶介導(dǎo)的切割。輕鏈（VL-CL）通過(guò)不可切割的接頭與重鏈構(gòu)建體的N-末端融合。然而，亮氨酸拉鏈不能完全防止同源二聚體的形成，因?yàn)樵贑HO細(xì)胞中不成比例的表達(dá)最可能是由于在轉(zhuǎn)染期間DNA比例不正確。被IgE激活時(shí)，兩個(gè)LUZ-Y雙特異性分子hFcεRIα×hFcγRIIb顯示出與各靶標(biāo)的理想結(jié)合并抑制了來(lái)自hFcεRIα/hFcγRIIb+大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞的組胺釋放。類(lèi)似地，EGFR×HER3雙特異性LUZ-Y抑制EGFR / HER3依賴(lài)性FaDu細(xì)胞的生長(zhǎng)。

雙特異性IgG也可由細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)組裝而成。代表MET（孔突變體）和EGFR（突變體突變體）特異性的半-IgG（一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈）分子分別在細(xì)菌培養(yǎng)物中表達(dá)。半-IgG通過(guò)蛋白A親和層析純化，并通過(guò)尺寸排阻色譜法分析以定量單體形式。兩種半-IgG在還原劑存在下混合，隨后氧化產(chǎn)生bsAb，bsAb以單價(jià)方式與靶結(jié)合。類(lèi)似地，表達(dá)單個(gè)半IgG的兩種菌株的細(xì)菌共培養(yǎng)被證明是生產(chǎn)bsAbs最快捷，最有效的方法。這些bsAb分子也抑制了MET×EGFR驅(qū)動(dòng)的腫瘤生長(zhǎng)。

另外，針對(duì)流感病毒A的抗HA1（Ab-002）和HA2（Ab-005）抗體通過(guò)其C-末端共價(jià)連接。 該方法涉及通過(guò)G4S接頭將細(xì)菌分選酶識(shí)別基序（LPETGG）融合至IgG重鏈的C端。在分選酶存在下使用環(huán)辛炔（DIBAC）或疊氮化物形式的點(diǎn)擊化學(xué)以促進(jìn)兩個(gè)抗體分子的共價(jià)結(jié)合。這種共價(jià)連接的抗體在37℃下保持穩(wěn)定3周，并且保留Fc效應(yīng)子功能。這些雙特異性共價(jià)連接的IgG，與單特異性分子相比效力，促進(jìn)了HA結(jié)合和抗病毒劑的廣泛應(yīng)用

此外，輕鏈配對(duì)也用于產(chǎn)生bsIg分子（κλ-體）（圖1O）。這是通過(guò)一個(gè)表達(dá)載體共表達(dá)具有兩條輕鏈（κ和λ）的單重鏈實(shí)現(xiàn)的。推測(cè)50％的產(chǎn)率將是κλ異二聚體。該策略涉及三步純化，以通過(guò)蛋白A/CH1樹(shù)脂分離（a）完整的IgG部分，（b）κ選擇樹(shù)脂分離κ輕鏈，和（b）λ選擇樹(shù)脂分離λ輕鏈。補(bǔ)料分批培養(yǎng)產(chǎn)生1.5g / L總IgG，41％是κλ異二聚體。

Smith等使用抗體同種型局部嵌合體來(lái)開(kāi)發(fā)可以觸發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞殺傷的bsAb。這種方法的基本原理是利用抗體同種型的差異蛋白A結(jié)合能力。已知IgG3不結(jié)合蛋白A，并且在CH3結(jié)構(gòu)域處分別具有對(duì)應(yīng)于IgG1 H435和Y436的二肽Arg-Phe，而IgG1能夠以高親和力結(jié)合蛋白A.此外，與蛋白質(zhì)A復(fù)合的IgG1的晶體結(jié)構(gòu)證實(shí)H435參與與蛋白質(zhì)A的相互作用。在抗CD3抗體中產(chǎn)生Fc取代物（H435R，Y436F）以使用普通輕鏈產(chǎn)生CD3xCD20bsAb。這種同種型局部嵌合體表現(xiàn)出與蛋白質(zhì)A的不對(duì)稱(chēng)結(jié)合，蛋白質(zhì)A被用于通過(guò)pH梯度分離異二聚體。雙特異性CD3×CD20 IgG1（REGN2280）的產(chǎn)率為43％。CD3×CD20（REGN1979）的IgG4同種型顯示T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)CD20+Raji淋巴瘤的細(xì)胞毒性，并抑制在注射人類(lèi)PBMCs時(shí)NOD SCIDγ（NSG）小鼠中的Raji淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

除了全長(zhǎng)bsAb設(shè)計(jì)的不同格式之外，還對(duì)bsAb片段設(shè)計(jì)進(jìn)行了重大的改變，所述bsAb片段設(shè)計(jì)缺乏Fc區(qū)或僅包含一些恒定區(qū)。bsAb片段的構(gòu)建塊包括納米抗體，人單域抗體，scFv和Fab。已經(jīng)記錄了超過(guò)25種bsAb片段形式，目前處于不同腫瘤治療的臨床試驗(yàn)中的大多數(shù)格式涉及橋接免疫效應(yīng)T細(xì)胞（CD3作為抗原）朝向腫瘤特異性抗原。

Blinatumomab是批準(zhǔn)用于治療的第一種bsAb片段和第二種雙特異性分子，是由與短肽接頭串聯(lián)的兩個(gè)scFv構(gòu)建的雙特異性T細(xì)胞參與者（BiTE）分子（圖1P;表2的臨床狀態(tài)）。 Blinatumomab使用一個(gè)臂來(lái)識(shí)別在B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）上高度表達(dá)的CD19，另一個(gè)臂募集在T細(xì)胞上表達(dá)的CD3，并且誘導(dǎo)T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞接觸并且有效腫瘤溶解細(xì)胞。有趣的是，就T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解而言，CD3×CD19雙特異性抗體的BiTE形式優(yōu)于其他形式，包括雙抗體（圖1Q），串聯(lián)雙抗體（Tandab）（圖1R）和四聯(lián)體。這一發(fā)現(xiàn)突出了相對(duì)的方向和距離在兩種scFv之間可能對(duì)如何將T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞緊密接觸以引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶解有顯著的影響。目前，一些基于BiTE，Tandab和雙親和靶向（圖1S）的雙特異性抗體片段正處于涉及CD3和腫瘤相關(guān)抗原的臨床試驗(yàn)中（表2）。

還研究了能夠通過(guò)CD16與NK細(xì)胞相互作用的bsAb片段的作用。格里森及其合作者證實(shí)bscFv CD16xCD19和三特異性scFvCD16xCD19xCD22構(gòu)建體通過(guò)共同給予NK細(xì)胞效應(yīng)子功能靶向腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)的功效。這些分子被稱(chēng)為雙特異性和三特異性殺傷細(xì)胞吸引器（BiKEs和TriKEs）（圖1T，U）。這樣的分子通過(guò)將特定的結(jié)合劑通過(guò)源自人肌肉醛縮酶的短接頭連接在一起而構(gòu)建。此外，已顯示針對(duì)CD16和CD33的BiKE構(gòu)建體激活CD16+NK細(xì)胞以裂解CD33 + HL60靶細(xì)胞。最近，具有針對(duì)IL-15的另外的特異性誘導(dǎo)的TriKE構(gòu)建體通過(guò)增加NK細(xì)胞增殖和存活而增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，脫顆粒和細(xì)胞因子產(chǎn)生對(duì)抗CD33+HL60細(xì)胞。Reusch等人設(shè)計(jì)了一種基于Tandab的抗CD16A×CD30雙特異性四價(jià)片段，發(fā)現(xiàn)這種形式優(yōu)于正常的單克隆抗CD30 IgG，優(yōu)化的單克隆抗CD30 IgG用于FcγR結(jié)合，雙抗體（雙特異性和二價(jià)抗CD16A 和抗CD30）形式來(lái)引發(fā)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的NK細(xì)胞裂解（CD30作為抗原）。這種抗CD16A×CD30雙特異性片段（稱(chēng)為AFM13）的格式正在進(jìn)行階段2臨床試驗(yàn)（表2），用于治療難治性或復(fù)發(fā)性霍奇金淋巴瘤患者。

過(guò)去5年的許多工作集中在將IgG恒定區(qū)設(shè)計(jì)為支架。IgG-Fc區(qū)和分離的CH結(jié)構(gòu)域在小尺寸，抗原靶向，效應(yīng)功能和血清半衰期方面顯示出有前景的優(yōu)點(diǎn)。

通過(guò)使CH3-CH3結(jié)構(gòu)域失穩(wěn)來(lái)開(kāi)發(fā)可溶性單體Fc（mFc）。構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)，在已知參與CH3結(jié)構(gòu)域同源二聚化的七個(gè)關(guān)鍵殘基中引入隨機(jī)突變，并首先選擇蛋白G的結(jié)合來(lái)富集折疊良好的突變體，然后針對(duì)人FcRn。選擇的克隆在其CH3結(jié)構(gòu)域中是多樣的，并且鑒定了促進(jìn)單體突變。每種含有6至7個(gè)突變的這些變體具有相當(dāng)?shù)偷慕怄湝囟?，但表現(xiàn)出與二聚體Fc相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和pH依賴(lài)性FcRn結(jié)合譜。通過(guò)靶向HIV-1包膜糖蛋白（ENV）的mFc67.3-m36VH融合物（圖1V）和中和病毒分離物來(lái)證明實(shí)驗(yàn)概念化。基于鑒定的mFc突變體，相同的組優(yōu)化mFc以產(chǎn)生具有較少突變和改善的熱穩(wěn)定性的突變體，同時(shí)保持與野生型Fc二聚體相似的pH依賴(lài)性FcRn結(jié)合。有趣的是，當(dāng)在細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，新的mFc突變體均顯示僅與FcγRI的選擇性結(jié)合，而不與包含F(xiàn)cγRIIa，F(xiàn)cγRIIb，F(xiàn)cγRIIIa和C1q的其他受體的選擇性結(jié)合。這種選擇性吸引力使得mFc突變體成為治療炎性的潛在載體，巨噬細(xì)胞炎癥性疾病顯示FcγRI的表達(dá)增加。此外，這種選擇性也排除了不需要的細(xì)胞毒性，例如來(lái)自FcγRIIIa的ADCC和來(lái)自C1q的CDC。

在將Fc保持為單體形式的另一種策略中，將天冬氨酸連接的聚糖結(jié)構(gòu)工程化到缺乏鉸鏈的IgG1Fc的CH3-CH3中。含有N-糖基化位點(diǎn)（位置364和407處的天冬酰胺）的突變體產(chǎn)生了具有野生型樣FcRn結(jié)合活性的穩(wěn)定的，可溶性的mFc支架，這表明N-糖基化引起功能性單體狀態(tài)并改善生物物理特性。

較小的支架如CH2結(jié)構(gòu)域也具有有趣的性質(zhì)，如正確折疊的結(jié)構(gòu)，構(gòu)象彈性，較低的二聚傾向以及相關(guān)的FcRn/C1q結(jié)合功能，這可以具有治療益處。發(fā)現(xiàn)含有二硫鍵突變（L12C和K104C）的CH2結(jié)構(gòu)域變體（m01）僅作為單體存在，并且保持比對(duì)應(yīng)物熱穩(wěn)定。此外，50％的單體CH2在6.8M的尿素濃度下展開(kāi)，而野生型CH2為4.8M。CH2結(jié)構(gòu)域（m01）的生物物理屬性進(jìn)一步優(yōu)化，通過(guò)開(kāi)發(fā)一個(gè)更短的版本，其中N-末端的非結(jié)構(gòu)化無(wú)規(guī)卷曲縮短了七個(gè)殘基（m01s）。該策略將CH2分離物的熔解溫度提高到82.6℃，提高了血清的穩(wěn)定性，并介導(dǎo)了與可溶性FcRn更強(qiáng)的結(jié)合。類(lèi)似地，與親本CH2分離物（m01s）相比，結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的設(shè)計(jì)允許將IgG1-CH3 FcRn識(shí)別基序改造成CH2骨架以賦予增強(qiáng)的pH依賴(lài)性FcRn結(jié)合，延長(zhǎng)血清半衰期和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)胞吞作用。

通過(guò)選擇抗HIV-1包膜糖蛋白（gp120）-CD4復(fù)合物，產(chǎn)生具有相同BC但具有不同的FG環(huán)的CH2片段，在BC和FG環(huán)中攜帶突變的CH2骨架中設(shè)計(jì)抗原識(shí)別活性，在這樣的相互作用中表明后者的重要性。一種這樣的分離物（m1a1）特異性識(shí)別HIV-1 gp120蛋白上的高度保守的CD4i表位，并在基于細(xì)胞的假病毒測(cè)定中中和HIV-1分離物。在另一種方法中，將靶向HIV-1gp41蛋白的隨機(jī)選擇的VH結(jié)構(gòu)域移植到“m01s”的BC / FG環(huán)中，而不影響側(cè)翼區(qū)以產(chǎn)生針對(duì)CH2結(jié)構(gòu)域的抗原（m2a1）。該結(jié)構(gòu)域與HIV-1包膜近端外部區(qū)域的sp62肽結(jié)合，中和了HIV-1分離物，并顯示pH依賴(lài)性的FcRn相互作用。

mFc和CH2結(jié)構(gòu)域的初步成功促進(jìn)了單體CH3（mCH3）支架的發(fā)展。來(lái)自先前報(bào)道的mFc分子的CH3結(jié)構(gòu)域的七個(gè)接觸殘基發(fā)生突變，并且發(fā)現(xiàn)CH 3單體存在需要突變的組合。這些突變負(fù)責(zé)更強(qiáng)的分子間疏水相互作用，導(dǎo)致了一個(gè)完整的，折疊的和熱穩(wěn)定的CH3單體。mCH3支架顯示與FcRn和蛋白質(zhì)G的顯著結(jié)合。此外，與HIV-1靶向抗體（m36.4）的VH結(jié)構(gòu)域融合的mCH3顯示令人滿(mǎn)意的穩(wěn)定性，病毒中和和pH依賴(lài)性FcRn結(jié)合。二聚體和單體支架之間的比較分析已顯示溶解度增加，血清穩(wěn)定性相當(dāng)，單體對(duì)pH依賴(lài)性FcRn的結(jié)合更高。這些性質(zhì)使得抗體支架有希望成為潛在的治療候選物。

通過(guò)酵母表面展示賦予針對(duì)抗原的特異性，F(xiàn)c也已經(jīng)被開(kāi)發(fā)為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域“Fcab”（圖1W）。將IgG1-CH3結(jié)構(gòu)域的AB和EF環(huán)隨機(jī)誘變，克隆到酵母表面展示載體中，并對(duì)抗HER2 / neu胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）進(jìn)行兩輪篩選。選擇的結(jié)合物再次在AB循環(huán)中隨機(jī)化并在HER2 / neu ECD上選擇。分離的Fcab分子之一（H10-03-6）顯示與HER2結(jié)合的特異性，保持與FcγRI/蛋白A的結(jié)合，并顯示與天然人Fc類(lèi)似的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征。在親和力成熟后，與親本分子相比，F(xiàn)cab表現(xiàn)出約10倍的與抗原的結(jié)合增強(qiáng)，并在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞系Calu-3引發(fā)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，但是效力為?20％比赫賽汀弱一倍。

向Fc片段中引入抗原結(jié)合能力可能危害穩(wěn)定性，因此在CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)設(shè)計(jì)另外的二硫鍵以提供增加的穩(wěn)定性。此外，這些突變不影響pH依賴(lài)性FcRn結(jié)合，這表明工程化Fc片段的正確折疊。類(lèi)似地，使用帶有CD16a調(diào)節(jié)突變的靶向HER2的Fcab（HAF3-4）證實(shí)了Fcab的免疫調(diào)節(jié)活性。兩種突變體均顯示與表達(dá)HER2的重組體或細(xì)胞表面的結(jié)合，并具有與ADCC效能相關(guān)的預(yù)期CD16a調(diào)節(jié)行為。之后，Woisetschlager及其同事通過(guò)同時(shí)接合HER2 / CD16a和ADCC的參與顯示了抗-HER2 Fcab（H10-03-6）的體內(nèi)腫瘤減少功效。

由于在酸性pH下的抗原-抗體相互作用可以負(fù)面影響藥物藥代動(dòng)力學(xué)，因此開(kāi)發(fā)了在pH6.0具有較弱結(jié)合的抗-HER2 Fcab（H10-03-6）變體。將AB和EF環(huán)中的殘基隨機(jī)化并使用酵母展示在pH7.4和6.0交替選擇抗HER2-ECD。分離的結(jié)合物在酸性pH下表現(xiàn)出較低的親和力，并且類(lèi)似地參與pH依賴(lài)性的HER2 +細(xì)胞方式。一年后，Leung等開(kāi)發(fā)了可降解HER2并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Fcab。隨機(jī)誘變IgG-Fc的AB和EF環(huán)殘基，并選擇通過(guò)酵母展示與HER2-ECD的結(jié)合。親和力成熟后，候選Fcab（FS102）對(duì)HER2-ECD表現(xiàn)出與帕妥珠單抗和曲妥珠單抗相當(dāng)?shù)腍ER2-ECD親和力，以及與天然Fc相當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)的血清半衰期。此外，分別觀察到對(duì)SKBr3和HCC1954乳腺癌細(xì)胞的EC50值分別為1.1和3.3nM，并且使用來(lái)自HER2 +患者的結(jié)腸直腸癌/胃癌異種移植物顯示了完整的腫瘤消退。這種作用與SKBr3細(xì)胞中的半胱天冬酶3/7活化以劑量依賴(lài)性方式相關(guān)，表明腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。

較小的抗體片段（納米抗體，人單域抗體，scFv或Fab）和bsAb片段相對(duì)于全長(zhǎng)IgG具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括穿透組織的能力，成本有效和簡(jiǎn)便的制造方法以及高產(chǎn)量。然而，它們的小尺寸導(dǎo)致更短的血清半衰期，更少的組織保留以及通過(guò)腎臟從血液中快速清除。對(duì)于blinatumomab，血清半衰期為2小時(shí)左右，而全長(zhǎng)IgG1的血清半衰期在2-3周左右。因此，患者需要至少3個(gè)療程的治療方案，每個(gè)周期由6周的周期持續(xù)輸注4周組成。另一方面，在成像和放射免疫治療中可能需要快速清除小尺寸的bsAb片段。

通過(guò)（1）IgG分子的Fc區(qū)或人血清白蛋白融合以延長(zhǎng)血清半衰期，可以使用特定的方法來(lái)增加血液和組織中的小bsAb片段的壽命。這些融合蛋白不僅增加bsAb片段的分子大小，從而保護(hù)它們不被排泄到體外，而且介導(dǎo)與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的FcRn結(jié)合進(jìn)入IgG血清穩(wěn)定通路; （2）抗體片段多聚化以增加血液中穩(wěn)定濃度的分子大小并增強(qiáng)抗原結(jié)合的效價(jià)。然而，多聚合方法具有賦予分子異質(zhì)性的風(fēng)險(xiǎn)，并且還可能通過(guò)交聯(lián)靶受體而導(dǎo)致不希望的效應(yīng);（3）和疏水性分子如聚乙二醇的連接，臨床證明的技術(shù)用于血清半衰期延長(zhǎng)。此外，其他聚合物如聚唾液酸，N-（2-羥丙基）甲基丙烯酰胺和葡聚糖也可以提供對(duì)小抗體片段的保護(hù)。

目前，有超過(guò)60個(gè)bsAb格式。值得注意的是，以BiTE為形式的blinatumomab的成功故事，但不包括diabody，Tandab和quadroma在內(nèi)的其他格式，表明雙特異性分子設(shè)計(jì)從一開(kāi)始就必須考慮多種格式。而且，這些變量格式的表達(dá)和純化需要根據(jù)每個(gè)設(shè)計(jì)量身定制的程序。 這對(duì)開(kāi)發(fā)雙特異性分子可能是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。 1總結(jié)了現(xiàn)有文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

近年來(lái)，基于不同支架的雙特異性分子的研發(fā)取得了重大進(jìn)展。已經(jīng)使進(jìn)入雙特異性臨床開(kāi)發(fā)的時(shí)代成為可能，其中兩種這樣的分子（卡妥莫單抗和blinatumomab）已被批準(zhǔn)用于人類(lèi)的臨床使用。bsAbs的領(lǐng)域一直是進(jìn)化的，具有革命性，這反映在我們獲得100％純異二聚體的能力上，完全逃避重和輕鏈錯(cuò)配，相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)/凈化/分析方法，重要的是對(duì)其潛在應(yīng)用的清晰思路。

全長(zhǎng)mAb具有相對(duì)較差的組織穿透能力。而B(niǎo)iTE，BiKE，TriKE等較小的抗體片段可有效穿透腫瘤組織，有效募集并激活免疫效應(yīng)細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞溶解。此外，通過(guò)靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和β-分泌酶以減少非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中的腦淀粉樣蛋白-β而在血腦屏障上遞送bsIg的最近成功可能打開(kāi)特定抗體腦遞送時(shí)代和治療神經(jīng)退行性疾病。在另一種可能性中，將非抗體小片段如lambody，親和體和適體與當(dāng)前的抗體支架結(jié)合可以擴(kuò)大雙特異性分子的治療庫(kù)。

此外，單體Ig結(jié)構(gòu)域支架和Fcab是靶向體內(nèi)難以到達(dá)的位點(diǎn)的有效新形式，并且增加了額外的抗原特異性以及增強(qiáng)的穩(wěn)定性，效應(yīng)功能和延長(zhǎng)的血清半衰期。這些特性使其適用于臨床驗(yàn)證。

將來(lái)，基于各種支架的雙特異性分子將代表治療各種臨床適應(yīng)癥的不可或缺的一類(lèi)治療選擇。但是，要在工業(yè)規(guī)模上改善生產(chǎn)和凈化的努力必須繼續(xù)保證收獲這些實(shí)體的全部利益。

文獻(xiàn)來(lái)源：

Liu H, Saxena A, Sidhu SS, Wu D.Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel Scaffolds.Front Immunol. 2017 Jan 26;8:38.