【原】揭秘，神經(jīng)細胞如何做ATAC-Seq

昵稱70100404 2020-09-01

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背景

近年來，利用高通量測序技術對轉座酶可接近的染色質區(qū)域進行測序分析（ATAC-Seq）已成為表觀遺傳學研究的基本工具。然而，這項技術很難在冷凍細胞樣品上進行，因為在提取細胞核之前冷凍細胞會損害細胞核的完整性并改變染色質結構，特別是在神經(jīng)元等比較脆弱的細胞中。為了克服這個缺點，本文研發(fā)了一種與ATAC-Seq兼容的神經(jīng)細胞冷凍方案。文章選用了一種與疾病相關的細胞類型，即人類誘導多能干細胞（iPSCs）分化而來的運動神經(jīng)元（iMNs）對該方法進行測試，這些細胞來源于一名脊髓性肌萎縮癥患者的成纖維細胞。

文章測試了兩種不同的細胞冷凍方法：快速冷凍和緩慢冷凍?？焖倮鋬鍪且环N使用液氮或干冰迅速降低樣品溫度的過程，以限制破壞性冰晶的形成。緩慢冷凍是逐漸降低樣品的溫度，并利用二甲基亞砜（DMSO）等冷凍保護劑防止冰晶成核，限制細胞在冷凍過程中的脫水。

文章發(fā)現(xiàn)，快速冷凍的iMNs不適合用于ATAC-Seq，但使用慢凍保存細胞進行測試，該方法是成功的，利用這種方法可以分離出高質量、完整的細胞核進行ATAC-seq，并且還驗證了新鮮和冷凍保存的iMNs的表觀遺傳結果上的一致性。

細胞冷凍

（1）快速冷凍（Flash-freezing）：將離心后細胞沉淀在液氮中快速冷凍。

（2）低溫保存（Cryopreservation）：將細胞沉淀重懸在低溫介質中（例如DMSO），放入含有異丙醇的凍存盒中，-80°C緩慢冷凍。該過程能夠實現(xiàn)的? 1°C /分鐘的冷卻速度。

（3）將快速冷凍和低溫保存的iMNs細胞-80°C低溫保存10天。

細胞解凍

（1）快速冷凍細胞：從-80°C 取出后，立即懸浮于冷的細胞裂解緩沖液中。

（2）低溫保存細胞：將凍存管從-80°C 取出后，并迅速放入37℃水浴鍋快速解凍約2min，然后將樣本轉移到預熱的含有1X蛋白酶抑制劑的1XPBS中。

圖1新鮮、速凍和低溫保存iPSCs來源的運動神經(jīng)元的 ATAC-Seq 流程

獲得新鮮（f）、速凍（FF）和慢速降溫保存（c）的iMNs 的 ATAC-Seq 數(shù)據(jù)。新鮮神經(jīng)元和冷凍神經(jīng)元來自同一個細胞池，并進行平行處理，以評估冷凍對 ATAC-Seq 結果的影響，不存在任何批次效應。

ATAC-seq實驗的質控非常重要，是評判實驗成敗的關鍵。（1）首先要分離得到高質量完整的細胞核，包括用臺盼藍或 DAPI 染色對細胞核進行形態(tài)學觀察，從定性角度看，單個完整的細胞核呈圓形或橢圓形，無明顯聚團。然后用自動細胞計數(shù)器對這些細胞核進行精確定量。（2）其次要有最佳的酶切條件，可以通過凝膠電泳來評估處理后的染色質樣本的質量，如Buenrostro et al（Jason D. Buenrostro, 1,2 Beijing Wu, 1 Howard Y. Chang, 2 and William J. Greenleaf1ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide）等人所述：如果染色質是完整的且轉座酶反應是最佳的，酶切擴增后的pattern圖跟單核小體、雙核小體、三核小體DNA長度吻合。

此外，我們以已知的開放染色質位點作為陽性對照，以 tn5不敏感位點作為陰性對照，通過實時 qPCR 分析測定DNA 可接近區(qū)域的富集情況，高質量ATAC-Seq樣本陽性對照位點的富集程度至少要高出10倍。

結論

1 新鮮和快速冷凍運動神經(jīng)元（iMNs）的ATAC-Seq

首先在新鮮和快速冷凍的iMNs上進行了ATAC-Seq。圖2顯示了兩個樣本代表性的ATAC-Seq結果。細胞核形態(tài)學觀察: 新鮮細胞的細胞核顯微鏡觀察相對較完整，質量較好；從速凍神經(jīng)元中提取細胞核則呈現(xiàn)出過多的團塊，這可能是由于核膜破裂，細胞核內遺傳物質DNA漏出造成的（圖2a）。轉座酶反應后，通過瓊脂糖凝膠電泳定性評判所得到的文庫質量。新鮮分離細胞核的文庫顯示出清晰的核小體定位，而快速冷凍神經(jīng)元的文庫顯示出DNA成彌散狀（圖2b）。

對新鮮樣品和快速冷凍樣品文庫進行二代測序，使用R包Gviz在基因組坐標上繪制測序數(shù)據(jù)，以進行手動檢查軌跡和峰的局部可視化（圖2c）。用高活性Tn5酶處理人的total DNA作為陰性對照，并將文庫與ATAC-Seq樣品一起測序。新鮮神經(jīng)元ATAC-Seq峰圖尖銳，與ENCODE數(shù)據(jù)庫中組蛋白修飾H3K4me3 的ChIP-seq數(shù)據(jù)信號重疊，MACS2 q值閾值設為0.05的情況下檢測到了超過7萬個峰。相比之下，快速冷凍細胞的reads均勻分布在整個基因組中，這一點與陰性對照的結果相似，并且僅檢測到461個顯著峰，這些峰只有一半與新鮮iMNs的峰重疊。這些結果表明，快速冷凍的iMNs不適合進行ATAC-Seq。

圖2新鮮細胞和速凍細胞ATAC-Seq過程中代表性結果

2 新鮮和低溫保存運動神經(jīng)元（iMNs）的ATAC-Seq

接下來文章比較了新鮮和低溫保存iMNs的ATAC-Seq結果。取100萬新鮮iMNs緩慢冷凍保存，解凍后用細胞通透性染料Hoechst 33342對神經(jīng)元進行染色，顯微鏡下觀察。如圖（圖3a）所示；與新鮮細胞核相似，緩慢凍存的神經(jīng)元核完整而且質量很好，通過凝膠電泳也檢測到了核小體的梯化pattern（圖3b）。使用Gviz軟件包可視化ATAC-Seq軌跡: 新鮮神經(jīng)元和低溫保存神經(jīng)元的數(shù)據(jù)均具有明顯的尖銳峰和較低的背景信號（圖3c）。

圖3 新鮮細胞和慢速凍存細胞ATAC-Seq過程中代表性結果

此外，實時qPCR的結果表明：新鮮樣品和低溫保存樣品在開放染色質位點的富集度較高，但快速冷凍樣本的結果較差，富集倍數(shù)還不到10（圖4b）。

圖4實時qPCR評估ATAC-Seq文庫的質量

與新鮮細胞的測序分析結果一樣，低溫保存的樣品獲得了7萬多個重要峰，并且從新鮮和低溫保存的iMNs獲得的峰在數(shù)量和形狀上高度重疊。這些結果表明，iMNs的緩慢冷凍保存與天然染色質的表觀遺傳學分析是一致的。

3. 新鮮和低溫保存的iMNs的定量比較

對新鮮和低溫保存的神經(jīng)元進行三次技術重復，評估低溫保存的方法是否會引起染色質可及性的改變?？傮w而言，新鮮樣本和低溫保存樣本的重復性較好（R ≥ 0.978）（圖5a）。值得注意的是，低溫保存和新鮮樣本之間的相關性幾乎和技術重復一樣高（R ≥0.973），這表明低溫保存成功的保存了reads在整個基因組上的分布。另外，新鮮和低溫保存的細胞的轉錄起始位點的分布高度相似（圖5b）。peak在基因組上的分布進一步說明了低溫保存和新鮮樣本之間的相似性（圖5c）。