[摘要]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)可用于臨床的蛋白多肽類藥物日益增多，且已成為治療眾多疾病的首選藥物。蛋白多肽類藥物在藥代動(dòng)力學(xué)方面仍有許多問(wèn)題需要解決，該類藥物的吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程與小分子藥物不同，各種內(nèi)源性蛋白的干擾也對(duì)該類藥物的分析造成影響。綜述蛋白多肽類藥物藥代動(dòng)力學(xué)分析方法研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹同位素標(biāo)記示蹤法、活體成像技術(shù)、免疫分析法、色譜法等方法的特點(diǎn)及其在蛋白質(zhì)多肽類藥物中的應(yīng)用。

    蛋白多肽類藥物具有特異性高、用藥劑量低、生理活性強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn)，可用于腫瘤、心血管疾病等多種病癥的治療。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)和生化技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白多肽類藥物已上市，且已成為臨床治療眾多疾病的首選藥物，因此，開(kāi)展蛋白多肽類藥物的相關(guān)研究具有重要意義。

    藥代動(dòng)力學(xué)（簡(jiǎn)稱藥動(dòng)學(xué)）是藥物研究中不可或缺的組成部分，而蛋白多肽類藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）過(guò)程往往與小分子藥物不同，這使得該類藥物的藥動(dòng)學(xué)分析方法與傳統(tǒng)藥物存在區(qū)別，增加了其檢測(cè)難度。筆者所在課題組曾發(fā)表蛋白多肽類藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征及分析方法的相關(guān)論述。近年來(lái)，該類藥物的藥動(dòng)學(xué)研究又有了諸多突破性進(jìn)展。本文從藥物研究策略和開(kāi)發(fā)方面簡(jiǎn)述蛋白多肽類藥物的ADME 機(jī)制及藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)（pharmacokinetics/pharmacodynamics，PK/PD）模型在人體藥動(dòng)學(xué)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹該類藥物傳統(tǒng)分析策略的技術(shù)發(fā)展及新型檢測(cè)方法的應(yīng)用，希望能為相關(guān)研究人員提供一些參考。

1、蛋白多肽類藥物的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)及模型

1.1 吸收

    蛋白多肽類藥物大多體內(nèi)穩(wěn)定性差且難以通過(guò)生理屏障，因此多采用非胃腸道途徑給藥，目前已上市的多肽類藥物中61% 通過(guò)注射方式給藥 。但在臨床應(yīng)用中，該給藥途徑存在耐受性不佳、需要頻繁注射等缺點(diǎn)，故開(kāi)發(fā)更為合理的新制劑及給藥途徑是提升蛋白多肽藥物體內(nèi)吸收的必然趨勢(shì)。緩釋注射劑可以改變藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，延長(zhǎng)體內(nèi)吸收及作用時(shí)間。結(jié)合聚乳酸羥基乙酸長(zhǎng)效微球是最為成功的蛋白多肽緩釋注射劑制備方法，如Ferring 公司的曲普瑞林注射劑（Decapeptyl）以PLGA為骨架，在體內(nèi)可以持續(xù)釋藥1 個(gè)月 。還有研究者提出無(wú)需預(yù)處理的即用型緩釋注射劑，如Apide 公司研發(fā)的含有己基側(cè)鏈的親脂性聚乳酸（polylactice acid，PLA）微球，其在常溫下不需有機(jī)溶劑即可結(jié)合多肽藥物，避免了混懸的前處理過(guò)程，使用該技術(shù)的曲普瑞林注射劑在大鼠體內(nèi)釋藥期可達(dá)6 個(gè)月 。

    口服蛋白多肽類藥物的開(kāi)發(fā)是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其可以降低用藥次數(shù)、延長(zhǎng)有效血藥濃度時(shí)間，適用于長(zhǎng)期用藥。該類藥物研發(fā)的瓶頸在于蛋白多肽在吸收過(guò)程中易受胃腸道蛋白酶降解，且對(duì)腸道黏膜的通透性低，這使得其直接口服的生物利用度不足2%。結(jié)合納米粒等載體及加入酶抑制劑均可以增強(qiáng)蛋白多肽類藥物的口服吸收，提高其生物利用度。如Chuang 等 利用鈣離子螯合劑乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethyleneglycol tetraaceticacid，EGTA）作為蛋白酶抑制劑，使口服胰島素的生物利用度達(dá)到21%。Castro 等  還提出使用聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）等多聚物成膜材料，將蛋白多肽藥物制成口腔膜劑，同樣可以延長(zhǎng)藥物酶解過(guò)程，增加其生物利用度。細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）是具有細(xì)胞膜穿透作用的短肽，可促進(jìn)蛋白多肽的腸道黏膜透過(guò)性。如Penetratin（天然CPPs）能顯著提高口服胰島素的腸道吸收。還有研究發(fā)現(xiàn)，Penetratin 的促吸收作用存在區(qū)域選擇型，如L-Penetratin 與D-Penetratin 分別在回腸、結(jié)腸中具有最強(qiáng)的促胰島素吸收能力。

1.2 分布

    由于具有極性強(qiáng)以及相對(duì)分子質(zhì)量較大的特點(diǎn)，蛋白多肽類藥物的組織分布過(guò)程緩慢，游離藥物主要通過(guò)細(xì)胞旁路中的血液-組織液對(duì)流以及細(xì)胞內(nèi)吞方式分布到外周組織。同時(shí)，該類藥物的跨膜滲透性低，大多被限制在血漿及組織間隙中，影響藥物的表觀分布容積（Vd）。如單抗靜脈注射后Vd 與血漿體積相近，組織與血液的藥物濃度的比值約為1%~10% 。值得注意的是，傳統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)表觀分布容積（Vdss）計(jì)算模型假設(shè)藥物在消除部位及循環(huán)系統(tǒng)的濃度可迅速達(dá)到平衡，即主要在中央室消除，而大分子藥物的消除多發(fā)生在外周組織。因此，對(duì)于具有復(fù)雜藥動(dòng)學(xué)過(guò)程（如靶點(diǎn)介導(dǎo)的組織結(jié)合）的蛋白多肽類藥物，采用生理藥動(dòng)學(xué)（physiologically basedpharmacokinetic，PBPK） 模型及靶點(diǎn)介導(dǎo)的藥物處置（target-mediated drugdisposition，TMDD）模型可以更準(zhǔn)確地描述藥物的體內(nèi)過(guò)程，并評(píng)估其組織分布。

    蛋白多肽的內(nèi)吞分布機(jī)制包括細(xì)胞吞噬及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。其中受體介導(dǎo)的內(nèi)吞是蛋白多肽分布至細(xì)胞的主要方式，該過(guò)程中藥物與受體的結(jié)合程度對(duì)藥物靶細(xì)胞分布尤為重要，有研究者利用相關(guān)受體作為靶標(biāo)篩選藥物。如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，Dai 等  使用噬菌體展示技術(shù)，篩選出與TfR結(jié)合的多肽BP9，該多肽對(duì)高表達(dá)TfR 的腫瘤細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。

    以trastuzumab emtansine 為代表的抗體藥物偶聯(lián)物（antibody drug conjugate，ADC）是目前抗體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其由單抗與細(xì)胞毒素偶聯(lián)結(jié)合構(gòu)成。從其結(jié)構(gòu)上看，抗體相對(duì)分子質(zhì)量約占ADC 藥物的98%，因此，ADC 整體藥物的體內(nèi)分布主要取決于裸抗體。細(xì)胞毒素的分布過(guò)程則通過(guò)ADC 藥物在靶細(xì)胞溶酶體中的逐步釋放實(shí)現(xiàn)，抗體作為ADC 中的載藥系統(tǒng)，其自身的分布過(guò)程可能會(huì)影響細(xì)胞毒素的體內(nèi)分布。因此，精確測(cè)定藥物不同部分在血液、組織及靶點(diǎn)的濃度是ADC藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究的必要步驟。此外，細(xì)胞毒素的數(shù)量也會(huì)影響ADC 藥動(dòng)學(xué)特性，如提高藥物抗體比（drugto antibody ratio，DAR）會(huì)使藥物清除率升高，半衰期縮短，結(jié)合過(guò)多的細(xì)胞毒素還會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)啟動(dòng)清除機(jī)制。因此，ADC 藥物的DAR 常以2~4 為最佳范圍。

1.3 代謝

    蛋白多肽類藥物通過(guò)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解進(jìn)行消除，其主要消除途徑包括Fc 受體介導(dǎo)的消除和靶點(diǎn)介導(dǎo)的消除。

1.3.1 Fc 受體介導(dǎo)的消除

    Fc 受體介導(dǎo)的消除具有非特異性，含有Fc 結(jié)構(gòu)的蛋白多肽均可通過(guò)IgG 結(jié)合細(xì)胞表面的Fcγ 受體，并被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行酶解。需要注意的是，內(nèi)源性IgG 的濃度遠(yuǎn)大于藥物的臨床劑量，因此該藥物消除途徑不會(huì)引起Fc 受體飽和，具有線性藥動(dòng)學(xué)特征。與上述過(guò)程不同，通過(guò)吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的蛋白藥物，可以在內(nèi)涵體的弱酸性環(huán)境下通過(guò)IgG結(jié)合新生兒Fc 受體 ( neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn) 而免受降解 。隨后IgG-FcRn 復(fù)合體被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，在生理pH 下釋放藥物。FcRn 對(duì)蛋白多肽的保護(hù)可以顯著延長(zhǎng)藥物的半衰期，其關(guān)鍵在于IgG與FcRn 的結(jié)合程度。有研究者嘗試使用生物膜干涉技術(shù)（BLI）測(cè)定IgG-FcRn 的親和力，由此推算出單抗藥物的體內(nèi)半衰期與臨床數(shù)據(jù)有較高相關(guān)性（R2 = 0.963）。

1.3.2 靶點(diǎn)介導(dǎo)的消除

    靶點(diǎn)介導(dǎo)的消除（target-mediatedclearance，TMC）是特異性消除途徑，包括細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞消除和可溶性靶點(diǎn)介導(dǎo)的免疫復(fù)合物形成。蛋白多肽藥物可以與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合并被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，在溶酶體中被降解成為氨基酸及肽段。但細(xì)胞表面的靶點(diǎn)數(shù)量通常有限，因此TMC 具有可飽和性并使藥物的藥動(dòng)學(xué)特征呈非線性。如西妥昔單抗（cetuximab）是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growthfactorreceptor，EGFR）的靶向藥物，在低劑量臨床試驗(yàn)中，西妥昔單抗的藥物清除率會(huì)隨其劑量上升而降低?？扇苄园悬c(diǎn)則通過(guò)與藥物結(jié)合形成免疫復(fù)合物，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞吞噬的方式介導(dǎo)消除。但體內(nèi)的可溶性靶點(diǎn)數(shù)量有限，因此該途徑不作為主要的蛋白多肽藥物消除方式。有研究發(fā)現(xiàn)，某些蛋白多肽藥物還可通過(guò)脫靶效應(yīng)非特異性地結(jié)合非靶點(diǎn)部位，加快靶向藥物的消除。如人源化的抗Aβ 抗體可以結(jié)合猴纖維蛋白原，其在食蟹猴中的清除率較高。因此，在靶向藥物篩選中，可采用蛋白芯片等技術(shù)驗(yàn)證藥物-靶點(diǎn)的結(jié)合。

    抗藥抗體（anti-drug antibodies, ADA）的中和作用是蛋白多肽藥物的另一種重要消除機(jī)制，藥物的免疫原性可以刺激機(jī)體產(chǎn)生ADA，藥物與ADA 結(jié)合形成的復(fù)合物被免疫系統(tǒng)清除，中和藥效并增加藥物清除速率，也會(huì)使藥物藥動(dòng)學(xué)特征呈非線性。

1.4 排泄

    蛋白多肽類藥物主要通過(guò)腎臟排泄。一般認(rèn)為相對(duì)分子質(zhì)量小于300 000 的蛋白可以從腎小球?yàn)V過(guò)，并在腎小管被上皮細(xì)胞從管腔中重吸收進(jìn)行酶解。但多數(shù)蛋白多肽的相對(duì)分子質(zhì)量較大，限制了藥物以原型藥形式在腎臟排泄。因此，蛋白多肽類藥物的體內(nèi)快速消除主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酶解實(shí)現(xiàn)，而非藥物排泄過(guò)程。例如，甘氨酸延伸型胃泌素17 在人體內(nèi)半衰期為4~7min，而其腎清除率僅為0.016 mL · min–1。

    在蛋白多肽類藥物研發(fā)過(guò)程中，通過(guò)聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾等方式改造原型藥是常用方法。PEG 在整體藥物中可以保護(hù)活性片段不受酶解，其增加的相對(duì)分子質(zhì)量也會(huì)限制腎排泄過(guò)程，提高藥物在循環(huán)中的穩(wěn)定性。如多肽EILDVP（Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro）被相對(duì)分子質(zhì)量為20 000 的直鏈甲氧基聚乙二醇（mPEG20 000）修飾后，在小鼠體內(nèi)的清除率降低為原值的1/25 。

1.5 藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)模型

    在蛋白多肽類藥物的研發(fā)過(guò)程中，建立合適的PK/PD 模型在確定給藥方案、設(shè)計(jì)治療模式等方面均具有優(yōu)勢(shì)，對(duì)新藥開(kāi)發(fā)及臨床研究起指導(dǎo)作用。美國(guó)FDA在2004 年發(fā)表的新藥關(guān)鍵路徑白皮書中就提出“采取基于模型的藥物研發(fā)策略”，將研究數(shù)據(jù)進(jìn)行整合與關(guān)聯(lián)，選取合適的PK/PD 模型以加快新藥開(kāi)發(fā)。目前，除傳統(tǒng)的房室PK/PD 模型外，TMDD 模型和PBPK 模型也逐漸用于蛋白多肽類藥物PK/PD 研究 。

    藥物在各種屬間的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程存在差異性，可以通過(guò)PK/PD 模型由臨床前數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)蛋白多肽藥物的人體藥動(dòng)學(xué)，決定藥物的人類首次（FIH）藥物試驗(yàn)劑量 。異率放大法常用于預(yù)測(cè)小分子藥物藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其通過(guò)經(jīng)驗(yàn)式對(duì)動(dòng)物的生理及藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單擬合，但無(wú)法描述蛋白多肽藥物的非線性TMDD 消除過(guò)程，因此準(zhǔn)確度不足。如Dong 等通過(guò)異率放大法由獼猴的數(shù)據(jù)推測(cè)抗體臨床藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，預(yù)測(cè)的Cmax 值是實(shí)際數(shù)據(jù)的5.3 倍。TMDD 模型中引入藥物-靶點(diǎn)結(jié)合物結(jié)合及解離常數(shù)（Koff 與Kon）等參數(shù)，描述藥物與靶點(diǎn)的交互作用，可以從藥物結(jié)合機(jī)制水平解釋蛋白多肽藥物的非線性TMDD 消除。同時(shí)，針對(duì)該類藥物中藥物-靶點(diǎn)結(jié)合物形成速率遠(yuǎn)大于解離速率的特性，可通過(guò)假設(shè)法簡(jiǎn)化模型以獲得更穩(wěn)定的數(shù)據(jù)；Singh等選取具有非線性藥動(dòng)學(xué)特征的單抗，建立使用快速結(jié)合假說(shuō)的TMDD-PK/PD 模型，假設(shè)單抗與靶點(diǎn)結(jié)合以及藥物-靶點(diǎn)結(jié)合物的解離迅速達(dá)到平衡，并使用平衡常數(shù)KD（KD = Koff / Kon）代替Koff 與Kon，PD 部分則采用細(xì)胞分布模型描述腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程，依據(jù)該P(yáng)K/PD 模型準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了檢驗(yàn)抗體的Vc 及Kel。

    PBPK 模型是目前蛋白多肽藥物人體藥動(dòng)學(xué)預(yù)測(cè)的主要方法，其以生理、生化及解剖數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過(guò)模擬機(jī)體的血液循環(huán)將藥物處置相關(guān)的組織器官相互連接，各房室均代表一種組織或器官。使用該模型預(yù)測(cè)大分子藥物人體藥動(dòng)學(xué)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）可以預(yù)測(cè)藥物在靶組織的濃度，從靶點(diǎn)水平描述藥物暴露劑量與藥效的關(guān)系； 2）考慮到不同病理生理?xiàng)l件，并定量描述其對(duì)藥物處置的影響；3）將各組織器官看做單獨(dú)隔室并相互連接，可以包含藥物的多種PK 及PD 過(guò)程，如在淋巴液中的對(duì)流及FcRn 結(jié)合等。但實(shí)際應(yīng)用中建立整體的PB/PK 模型相當(dāng)復(fù)雜且需要大量的數(shù)據(jù)，近年又發(fā)展出Hybrid-PB/PK 及Minimal-PB/PK 模型。Minimal-PB/PK 模型對(duì)PB/PK 模型進(jìn)行大幅簡(jiǎn)化，其將機(jī)體分為血液、淋巴液和組織，并依據(jù)藥物對(duì)流機(jī)制將其相互連接，組織內(nèi)的器官又按血管內(nèi)皮緊密程度歸為兩類（Vtight 及Vleaky）且可分別描述藥動(dòng)學(xué)行為。當(dāng)受試者僅能提供血藥濃度數(shù)據(jù)時(shí)，該模型預(yù)測(cè)抗體的人體藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)較房室模型的準(zhǔn)確度更高。PK/PD 在人體藥動(dòng)學(xué)預(yù)測(cè)上的優(yōu)勢(shì)使其還可用于推算FIH 劑量。最低預(yù)期生物劑量法（minimalanticipatedbiological level，MABEL）是歐洲藥品管理局（EMA）于2007 年引入的FIH 劑量預(yù)測(cè)法，已有報(bào)道將PK/PD模型應(yīng)用于蛋白多肽類藥物的MABEL 計(jì)算 。

2、蛋白多肽類藥物藥動(dòng)學(xué)分析方法

    蛋白多肽類藥物在進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究的過(guò)程中受到諸多因素的制約，主要原因是該類藥物的用藥劑量小、血藥濃度低且易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，這就要求在研究過(guò)程中選擇靈敏度高且專屬性強(qiáng)的分析方法。現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展為蛋白多肽類藥物的藥動(dòng)學(xué)研究提供了多種分析手段，可根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。

2.1 同位素標(biāo)記示蹤法

    同位素標(biāo)記示蹤法包括放射性同位素示蹤技術(shù)與穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)。穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)利用普通同位素與穩(wěn)定性同位素的質(zhì)量差進(jìn)行測(cè)定，可用于人體代謝動(dòng)力學(xué)研究。如Zhou 等  根據(jù)前體-產(chǎn)物原則，以血液中游離苯丙氨酸豐度為前體池，通過(guò)輸注L- -苯丙氨酸對(duì)人血清蛋白代謝進(jìn)行分析。而放射性同位素示蹤法是分析蛋白多肽類藥物的經(jīng)典方法，具有應(yīng)用范圍廣且簡(jiǎn)捷直觀的特點(diǎn)，尤其適合對(duì)其組織分布與排泄的研究。目前，F(xiàn)DA 已將放射同位素法測(cè)定的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)作為藥物安全性評(píng)價(jià)的有效依據(jù)。但因具有放射性污染的特性，限制了該方法在臨床藥動(dòng)學(xué)研究中的應(yīng)用。

    蛋白多肽藥物的體內(nèi)代謝是其藥動(dòng)學(xué)研究的難點(diǎn)，這主要是由于該類藥物的代謝途徑復(fù)雜，且代謝片段會(huì)進(jìn)入體內(nèi)氨基酸庫(kù)，干擾分析過(guò)程。同位素示蹤法具有直接測(cè)定過(guò)程穩(wěn)定、檢測(cè)限極低及前處理過(guò)程簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，有望成為研究蛋白多肽藥物代謝及體內(nèi)處置的有力工具。放射性同位素標(biāo)記法是回收體內(nèi)藥物代謝物的理想方法，通常將三氯醋酸（TCA）沉淀法、HPLC 等方法與同位素示蹤法聯(lián)用，按照相對(duì)分子質(zhì)量及保留時(shí)間對(duì)代謝物進(jìn)行分離確證。如廖建民等 采用125I 標(biāo)記甲狀旁腺素rhPTH(1~34) 以測(cè)定藥物在大鼠體內(nèi)血藥濃度，并通過(guò)HPLC 圖譜中保留時(shí)間判定代謝物峰。此外，同位素示蹤法可以結(jié)合質(zhì)譜，根據(jù)藥物代謝特性及代謝物確證結(jié)果分析代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合藥物已知的ADME 特性推測(cè)體內(nèi)代謝途徑，目前常用的是HPLC-RAM/MS 技術(shù)。

2.2 活體成像技術(shù)

    活體成像技術(shù)是指應(yīng)用多種成像手段，對(duì)活體狀態(tài)下的生物行為進(jìn)行組織及細(xì)胞水平研究的分析方法。該技術(shù)在藥物的組織分布研究上有顯著優(yōu)勢(shì)，能夠使藥物的體內(nèi)分布過(guò)程可視化，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地檢測(cè)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，還可以非侵入性的在同一實(shí)驗(yàn)體連續(xù)獲得數(shù)據(jù)，減小個(gè)體差異。目前常用于蛋白多肽藥動(dòng)學(xué)分析的活體成像技術(shù)有核素成像（PET/SPECT）及熒光標(biāo)記技術(shù)。ter Weele 等  采用89Zr 標(biāo)記間皮素抗體（AMA），通過(guò)PET 定量檢測(cè)藥物在荷瘤小鼠內(nèi)的分布，結(jié)果顯示，89Zr-AMA 在給藥后6 天內(nèi)逐漸聚集于腫瘤部位，在血液及各組織器官中的分布則持續(xù)降低；還使用近紅外熒光染料IRDye 800CW 標(biāo)記AMA 驗(yàn)證藥物的微觀動(dòng)力學(xué)分布，通過(guò)腫瘤/ 背景比值（TBR）證明AMA 可有效分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

    結(jié)合多種技術(shù)的成像模式（如PET/CT）是活體成像的發(fā)展方向之一，其可以同時(shí)獲得功能顯像與解剖結(jié)構(gòu)信息，用于臨床治療方案的改善。貝伐單抗（bevacizumab）屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑，而整合素在腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)。Minamimoto 等  使用18F 標(biāo)記靶向整合素αvβ3 的RGD（Arg-Gly-Asp）多肽FPPRGD2，作為PET/CT 的示蹤劑注入腫瘤患者體內(nèi)，通過(guò)比較患者接受貝伐單抗治療前后18F-FPPRGD2 的組織分布，為預(yù)測(cè)藥物治療的預(yù)后效果提供依據(jù)。

2.3 免疫分析法

2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

    酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）是目前蛋白多肽類藥物藥動(dòng)學(xué)研究普遍采用的方法，具有特異性好、操作簡(jiǎn)單快速及可進(jìn)行高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合進(jìn)行臨床藥動(dòng)學(xué)研究，并受到藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可及推薦。數(shù)據(jù)顯示，上市的95% 蛋白多肽藥物在藥動(dòng)學(xué)分析中使用以ELISA為代表的免疫分析法。檢測(cè)對(duì)象多樣性是ELISA 方法的突出特點(diǎn)，這使其可以用于絕大部分蛋白多肽藥物的藥動(dòng)學(xué)分析，實(shí)踐中往往根據(jù)藥物特性選取相應(yīng)的檢測(cè)模式。如雙抗夾心法適用于多價(jià)抗原的檢測(cè)，含有單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的小分子蛋白多肽使用間接法進(jìn)行測(cè)定，陳巨冰等 建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法測(cè)量聚乙二醇安替安吉肽的血藥濃度。近年來(lái)，ELISA 還被用于測(cè)定血清樣本中的ADA。蛋白多肽的免疫原性使機(jī)體產(chǎn)生ADA，以中和藥效且改變藥物清除。因此，ADA 的測(cè)定是大分子藥物藥動(dòng)學(xué)研究的重要內(nèi)容。橋式ELISA 是最常用的ADA 檢測(cè)方法，高柳村等  在酶標(biāo)板中預(yù)先包被BLyS 抗體，以捕獲食蟹猴血清中的抗BLyS 抗體，再使用生物素標(biāo)記的藥物作為檢測(cè)試劑結(jié)合已捕獲的橋連ADA，該方法靈敏度達(dá)到0.64 μg · L–1。橋式ELISA 允許存在5% 的假陽(yáng)性結(jié)果，因此，在初篩后還需競(jìng)爭(zhēng)性加入過(guò)量未標(biāo)記藥物以驗(yàn)證樣品響應(yīng)程度。

    通常認(rèn)為ELISA 方法具有以下不足： 1）無(wú)法區(qū)分藥物的活性及無(wú)活性形式；2）難以準(zhǔn)確測(cè)量組織樣本；3）易受內(nèi)源性及外源性物質(zhì)干擾；4）相關(guān)試劑的制備周期長(zhǎng)。需要注意的是，生物基質(zhì)中結(jié)合型ADA可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合藥物的ELISA 測(cè)定位點(diǎn)，使ELISA 的測(cè)定結(jié)果較真實(shí)值低。有報(bào)道對(duì)比了ELISA 和LC-MS測(cè)定的食蟹猴內(nèi)PEG 蛋白藥物血藥濃度數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示LC-MS 測(cè)定的藥時(shí)曲線下面積為ELISA 方法測(cè)定值的1.53 倍 ?？梢?jiàn)，ELISA 作為應(yīng)用最為廣泛的免疫分析法，仍需要不斷完善及改進(jìn)。

2.3.2 電化學(xué)發(fā)光免疫分析

    電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）結(jié)合了電化學(xué)發(fā)光及免疫檢測(cè)技術(shù)，在國(guó)外已廣泛用于臨床檢測(cè)和藥物分析。與傳統(tǒng)方法相比，ECLIA 易于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的特點(diǎn)使其可以極大提升分析速度及穩(wěn)定性，電化學(xué)發(fā)光技術(shù)則確保了方法的高靈敏度。因此，ECLIA 可進(jìn)行多元檢測(cè)及均相測(cè)量，尤其適用于分析體液等復(fù)雜樣品中含量極低的藥物，目前已有多種上市單抗藥物在臨床藥動(dòng)學(xué)階段使用ECLIA，如siltuximab 、pembrolizumab  等，ECLIA 有望成為繼ELISA 后普遍采用的免疫分析法。

2.3.3 表面等離子共振技術(shù)

    表面等離子共振技術(shù)（SPR）是利用金屬薄膜物理發(fā)光現(xiàn)象的新型免疫檢測(cè)法，基于該技術(shù)的生物傳感器由微流射系統(tǒng)、傳感器芯片及SPR 光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)組成，其原理是待測(cè)物在芯片表面結(jié)合抗原/抗體改變金屬薄膜折射率，進(jìn)而影響SPR 共振角。近年來(lái)多家公司推出商品化的SPR傳感器，并大量用于大分子的相互作用研究及高通量測(cè)定。槲寄生凝集素Ⅰ（ML-1）是一種高效抗腫瘤蛋白，Tao 等使用Plasmonic 公司的SPR 傳感器測(cè)定緩沖液與人血清中的ML-1，檢測(cè)限分別為1 和1.5 mg · L–1。與ELISA 法相比，SPR 的檢測(cè)速度更快，且無(wú)需樣品預(yù)處理。同時(shí)由于SPR 能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地反映分子間相互作用，可以建立基于SPR 傳感器的體外模型，以驗(yàn)證藥物的特異性吸收及結(jié)合動(dòng)力學(xué)。當(dāng)前，SPR 檢測(cè)蛋白多肽藥物的技術(shù)還不夠成熟，相關(guān)方法的建立仍需完善。

2.4 色譜法

2.4.1 高效液相色譜

    HPLC 在小分子藥物藥動(dòng)學(xué)分析中被廣泛應(yīng)用。但由于蛋白多肽相對(duì)分子質(zhì)量較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除少數(shù)藥物（如胰島素）可直接測(cè)定外，HPLC常需與其他靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MSn）是當(dāng)前蛋白多肽藥物藥動(dòng)學(xué)分析的主要方法，它將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合，可以同時(shí)測(cè)定多種藥物組分，是復(fù)雜化合物整體檢測(cè)的理想方法，如ADC 藥物的藥動(dòng)學(xué)分析多選取LC-MSn。

    一般認(rèn)為由于質(zhì)譜檢測(cè)范圍與蛋白分離方法的限制，LC-MSn 更常用于多肽藥物。而酶解法的出現(xiàn)使LCMSn的檢測(cè)范圍拓展到相對(duì)分子質(zhì)量為10 000~15 000 的蛋白類藥物。與傳統(tǒng)在整體水平分析的方法不同，酶解法是將蛋白多肽藥物酶切成合適肽段并選取特異性定量肽進(jìn)行測(cè)定。合適的定量肽對(duì)于酶解法尤為重要，其選取需依照以下原則：1）在酶解片段中的唯一性，如抗體的定量肽多選擇互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）的特異性序列；2）靈敏度高，可以代表原型藥進(jìn)行定量；3）不含易被修飾的氨基酸片段，在酶解及分析過(guò)程中保持穩(wěn)定。Adnectin 是源于人纖維連接蛋白的抗體類似物，其與IgG1Fc 片段融合生成BMS-986089 蛋白。Zhu 等 用胰蛋白酶酶解BMS-986089，并選取Adnectin 中CDR 的“ITYGGNSPVQEFTVPGR” 片段作為定量肽，通過(guò)LC-MS/MS 測(cè)定小鼠血藥濃度，檢測(cè)范圍達(dá)到390~100 000μg · L–1。此外，研究人員還提出在酶解肽段中選取“監(jiān)視肽”進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，并結(jié)合其在蛋白序列中的位置獲取藥物結(jié)構(gòu)信息，也可作為酶解法的驗(yàn)證手段。

    血漿等復(fù)雜樣品中含有大量鹽類及內(nèi)源性蛋白，會(huì)對(duì)定量肽的分析產(chǎn)生干擾，影響其準(zhǔn)確度與靈敏度。通常可以結(jié)合固相萃?。⊿PE）或免疫捕獲等前處理方法去除雜質(zhì)，減少基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí)，酶解法采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記（SIL）的定量肽或整體蛋白作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)樣品處理產(chǎn)生的離子化進(jìn)行校正，同樣可以提高靈敏度及準(zhǔn)確度。如上述的BMS-986089 測(cè)量過(guò)程中選用標(biāo)記的定量肽作為內(nèi)標(biāo)，該方法的準(zhǔn)確度與精密度較高（均< 20%）。也有文獻(xiàn)報(bào)道，采用SIL 的雙內(nèi)標(biāo)會(huì)使定量更加準(zhǔn)確。目前，使用酶解法進(jìn)行蛋白類藥物藥動(dòng)學(xué)分析的LC-MS 技術(shù)（PrD-LC-MS）已被廣泛接受并使用，相關(guān)的行業(yè)白皮書也已經(jīng)發(fā)表。

2.4.2 高效毛細(xì)管電泳

    高效毛細(xì)管電泳（HPCE）是以高壓電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)待測(cè)物在毛細(xì)管中按分配系數(shù)和濃度進(jìn)行分離的技術(shù)。相較于HPLC，HPCE 的進(jìn)樣量更少（僅為nL 級(jí)），分離性能更高，是分析痕量組分及復(fù)雜樣品的有力手段。

    HPCE 可以通過(guò)與質(zhì)譜聯(lián)用獲取結(jié)構(gòu)信息，定性檢測(cè)蛋白多肽藥物。因此，CE-MS 同時(shí)具有高效分離及定性鑒別能力，是比LC-MSn 更加理想的聯(lián)用方法。CE-MS 分為在線聯(lián)用和離線聯(lián)用方式，在線聯(lián)用分析速度快且樣品損失少，因而應(yīng)用更為廣泛，其難點(diǎn)在于HPCE 的低流速（nL · min–1）要求分離樣品需全部轉(zhuǎn)移到MS 中進(jìn)行離子化。因此，設(shè)計(jì)合適的接口是CE-MS 技術(shù)的關(guān)鍵，CE-ESI-MS 接口目前最為常用。Nguyen 等  設(shè)計(jì)的無(wú)鞘液CE-ESI-MS 接口用于CE-MS 在線檢測(cè)亮氨酸腦啡肽（LEK）藥物，最低檢測(cè)限達(dá)到0.045 μmol · L–1。該技術(shù)還可以對(duì)含有胰島素、組織因子、α-Synuclein 及BSA 4 種蛋白的混合樣品進(jìn)行有效分離及鑒定，其中每種蛋白含量?jī)H為30 fmol。Schiavone 等  報(bào)道了電流泵接口連接毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）及ESI-MS/MS，并從BSA 酶解產(chǎn)物中分離出31 個(gè)肽段，覆蓋了BSA 中52% 的序列。近年來(lái)，有研究者嘗試將酶微反應(yīng)器或微流體裝置聯(lián)合CE-MS 用于蛋白多肽的分析，Black 等  將微流體芯片-CE-MS及LC-MS 用于分析牛血紅蛋白酶解物，與LC-MS 相比，微流體芯片-CE-MS 的分離速度及峰容量都有顯著提升。目前，CE-MS 多作為傳統(tǒng)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的補(bǔ)充或競(jìng)爭(zhēng)方法，但隨著接口技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，該方法在蛋白多肽藥物的研究中會(huì)愈發(fā)重要。

3、結(jié)語(yǔ)

    蛋白多肽類藥物的生理活性強(qiáng)、療效高、毒副作用小，是醫(yī)藥研發(fā)的重要方向，獨(dú)特的理化性質(zhì)使該類藥物的藥動(dòng)學(xué)行為與小分子藥物區(qū)別較大，因此其藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需注意以下幾點(diǎn)：1）采用可靠的分析方法，對(duì)游離藥物、代謝物和結(jié)合藥物的分離測(cè)定是蛋白多肽藥物研究亟待解決的問(wèn)題，當(dāng)前普遍采用的ELISA 及LC-MSn 并不完全滿足上述要求，但傳統(tǒng)方法的改進(jìn)及新技術(shù)的推廣可幫助研究者更好地制定分析策略；2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理, 包括動(dòng)物選擇、劑量確定、給藥途徑等，給藥途徑及劑量確定需結(jié)合藥物特點(diǎn)，綜合藥理學(xué)和毒理學(xué)數(shù)據(jù)擬定，動(dòng)物選擇則要求藥物在受試動(dòng)物的ADME 盡量與人體接近；3）根據(jù)已知的ADME 信息及作用機(jī)制選取藥動(dòng)學(xué)模型進(jìn)行分析，闡明藥物的藥動(dòng)學(xué)行為，如TMDD 模型可描述靶向藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合過(guò)程，在機(jī)制水平反映藥物體內(nèi)行為；4）結(jié)合毒理學(xué)和藥效學(xué)進(jìn)行綜合分析，蛋白多肽的免疫原性往往使宿主產(chǎn)生ADA，從而影響藥動(dòng)學(xué)反應(yīng)，可通過(guò)免疫原性評(píng)價(jià)來(lái)反映藥物藥動(dòng)學(xué)特征。而綜合藥效學(xué)建立PK/PD 模型則有助于非臨床藥動(dòng)學(xué)研究的轉(zhuǎn)化，為臨床實(shí)驗(yàn)提供劑量依據(jù)。

    從整體上進(jìn)行蛋白多肽類藥物的藥動(dòng)學(xué)分析相當(dāng)復(fù)雜，研究藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程及生物活性片段也具有一定難度。現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展給蛋白多肽類藥物的藥動(dòng)學(xué)研究提供了多樣的分析方法，但由于其理化性質(zhì)具有特殊性，尚無(wú)一種分析方法可以完全滿足藥動(dòng)學(xué)研究的所有需求，通常需要聯(lián)用多種技術(shù)，進(jìn)行相互補(bǔ)充及驗(yàn)證才能得到可靠的結(jié)果。相信隨著更多分析技術(shù)以及樣品處理方法的應(yīng)用，未來(lái)可以獲得更加準(zhǔn)確可靠的蛋白多肽類藥物藥動(dòng)學(xué)信息，為該類藥物的研制與開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。