前言

自從2014年anti-PD-1單抗Opdivo和Keytruda被批準(zhǔn)上市以來(lái)，腫瘤免疫治療的熱浪席卷全球，取得了空前的成功。除Opdivo和Keytruda外，還有anti-CTLA-4單抗Yervoy以及anti-PD-L1單抗Tecentriq獲FDA批準(zhǔn)上市。這些免疫檢查點(diǎn)抑制劑在黑色素瘤，非小細(xì)胞肺癌，腎細(xì)胞癌，霍奇金淋巴瘤，膀胱癌等多種癌癥中表現(xiàn)出了令人欣喜的療效，其中Keytruda還在2016年獲批一線治療PD-L1高表達(dá)(>50%)的非小細(xì)胞肺癌。然而免疫檢查點(diǎn)抑制劑并不是萬(wàn)能的“神藥”，也存在其缺陷，其中一項(xiàng)就是由于耐藥性而導(dǎo)致的響應(yīng)率不高與腫瘤復(fù)發(fā)再進(jìn)展。腫瘤免疫耐藥可分為原發(fā)性耐藥(primary resistance)，適應(yīng)性免疫耐藥(adaptive immune resistance)以及獲得性耐藥(acquired resistance)。在anti-PD-1療法治療黑色素瘤中，約有60%的患者不響應(yīng)(primary resistance)，還有一部分患者在初始響應(yīng)后腫瘤出現(xiàn)了再進(jìn)展。本文就詳細(xì)介紹下腫瘤免疫耐藥的機(jī)制。

▲     黑色素瘤患者對(duì)anti-PD-1療法的臨床響應(yīng)

導(dǎo)致原發(fā)性/繼發(fā)性耐藥的腫瘤內(nèi)在原因

這些原因主要是腫瘤細(xì)胞上特定基因或通路的表達(dá)或上調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)以及功能受到抑制。具體如下:

▲     導(dǎo)致免疫療法耐藥的腫瘤內(nèi)在原因

• MAPK通路的激活與或PTEN表達(dá)的缺失而引起的PI3K通路的增強(qiáng)。癌基因信號(hào)通過(guò)MAPK通路導(dǎo)致VEGF與IL-8的產(chǎn)生，從而抑制T細(xì)胞的招募與功能。此外，在多種腫瘤中，腫瘤抑制基因PTEN表達(dá)缺失從而PI3K通路增強(qiáng)，這與IFNγ，顆粒酶B的基因表達(dá)量降低以及腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞的數(shù)目減少是高度相關(guān)的。

• WNT/β-catenin信號(hào)通路的持續(xù)表達(dá)。癌基因信號(hào)通過(guò)穩(wěn)定β-catenin導(dǎo)致WNT信號(hào)通路持續(xù)激活，從而將T細(xì)胞排除在腫瘤之外。在人Non-T-cell-inflamed的黑色素瘤中，腫瘤內(nèi)在的β-catenin信號(hào)基因高度表達(dá)，且在腫瘤微環(huán)境中缺少T細(xì)胞與CD103+ DC細(xì)胞。

• 腫瘤上PD-L1的高表達(dá)。腫瘤上高表達(dá)的某些配體如PD-L1，會(huì)抑制抗腫瘤T細(xì)胞的應(yīng)答。多種機(jī)制可能導(dǎo)致PD-L1高表達(dá)，包括PTEN的缺失或PI3K/AKT的突變，EGFR突變，MYC過(guò)表達(dá)，CDK5基因破壞以及PD-L1基因3’-UTR的截短。目前還不知道PD-L1的高表達(dá)是否會(huì)對(duì)anti-PD-1/PD-L1的響應(yīng)有影響，但是它會(huì)影響其他的腫瘤免疫療法。

• IFNγ信號(hào)通路的缺失。由腫瘤特異的T細(xì)胞產(chǎn)生的IFNγ，能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞或抗原遞呈細(xì)胞上的相應(yīng)受體，從而發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫響應(yīng)。IFNγ能夠增強(qiáng)MHC分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤抗原提呈作用。IFNγ也能夠招募其他的免疫細(xì)胞，或者直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。因此腫瘤細(xì)胞上IFNγ通路相關(guān)蛋白，如IFNγ受體IFNGR1與IFNGR2，IFNγ受體鏈JAK1與JAK2，STATs，IRF1等突變與缺失，都會(huì)導(dǎo)致對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的耐藥。

• 缺少腫瘤抗原，從而導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)法激活。免疫療法依賴于腫瘤抗原特異的T細(xì)胞。在人黑色素瘤，腎細(xì)胞癌，非小細(xì)胞肺癌中，DNA突變頻率高，腫瘤免疫原性更強(qiáng)，因而對(duì)anti-PD-1療法響應(yīng)更好。而在胰腺癌以及前列腺癌中，DNA突變頻率低，腫瘤免疫原性低，對(duì)anti-PD-1療法響應(yīng)差。

• 抗原提呈機(jī)制存在缺陷。在某些情況下，由于抗原加工過(guò)程中的蛋白酶體成員，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，MHC本身以及beta-2-微球蛋白(B2M)的功能缺陷，會(huì)導(dǎo)致抗原提呈機(jī)制不能有效地將腫瘤抗原提呈到細(xì)胞表面。B2M在HLAI家族的折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，若其喪失功能，則CD8+T細(xì)胞失去了識(shí)別功能。

• 存在一系列特定基因的表達(dá)。在對(duì)PD-1療法沒(méi)有響應(yīng)的腫瘤中，有一些基因表達(dá)被富集，被稱為innate anti-PD-1 resistance signature，或IPRES。這些基因與間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，全能型以及傷口愈合相關(guān)，且更傾向于表達(dá)在胰腺癌等對(duì)PD-1不響應(yīng)的腫瘤中。

導(dǎo)致原發(fā)性/繼發(fā)性耐藥的腫瘤外部原因

這些原因是由于腫瘤微環(huán)境中一些成員發(fā)揮抗癌免疫響應(yīng)的抑制作用，主要包括調(diào)節(jié)T細(xì)胞Tregs，髓樣抑制細(xì)胞MDSCs，M2巨噬細(xì)胞，其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)與抑制性細(xì)胞因子等。

▲      導(dǎo)致免疫療法耐藥的腫瘤外部原因

• Tregs。Tregs能通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子或者通過(guò)直接的細(xì)胞接觸來(lái)抑制效應(yīng)T細(xì)胞Teffs的響應(yīng)。許多人腫瘤中發(fā)現(xiàn)了浸潤(rùn)的Tregs，且鼠模型中去除腫瘤微環(huán)境中的Tregs能夠顯著提高免疫響應(yīng)。由于CTLA-4在Tregs上高表達(dá)，anti-CTLA-4能夠顯著提高Teffs/Tregs的比例，從而提高腫瘤對(duì)免疫療法的響應(yīng)。

• Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)。MDSCs在多種病理?xiàng)l件包括腫瘤，發(fā)揮著免疫響應(yīng)調(diào)節(jié)因子的作用。人MDSCs表達(dá)CD11b+與CD33+，但是不表達(dá)HLA-DR以及系種特異的抗原CD3，CD19與CD57。MDSCs能夠促進(jìn)血管生長(zhǎng)，腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中MDSCs的存在與降低的生存率以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法的響應(yīng)率相關(guān)。目前實(shí)驗(yàn)中使用PI3Kγ抑制劑來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，在老鼠模型中，PI3Kγ抑制劑與anti-PD-1聯(lián)用表現(xiàn)出了良好的腫瘤抑制效果。

• M2 macrophages。腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)也能夠影響免疫治療的響應(yīng)。TAMs包括M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞，在大多數(shù)情況下M2巨噬細(xì)胞占TAMs的大多數(shù)。其中M1巨噬細(xì)胞能夠高表達(dá)IL-12，IL-23，MHC以及B7家族分子來(lái)促進(jìn)抗原提呈與Th1細(xì)胞的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用；而M2巨噬細(xì)胞能夠分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10與TGF-β，從而抑制免疫響應(yīng)與促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。臨床上TAMs的數(shù)目越多，腫瘤預(yù)后就越差。臨床前實(shí)驗(yàn)使用巨噬細(xì)胞集落刺激生長(zhǎng)因子受體1(CSF-1R)的抑制劑，能夠顯著減少TAMs數(shù)目，抑制腫瘤生長(zhǎng)。CSF-1R抑制劑與anti-CTLA4或anti-PD1再加上吉西他濱聯(lián)用，能夠有效緩解單獨(dú)anti-CTLA-4或anti-PD1不響應(yīng)的鼠胰腺癌模型。

• 其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)。除了PD-1與CLTA-4，T細(xì)胞上還存在其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)，包括TIM-3，LAG-3，BTLA，TIGIT，和VISTA等。具體可見(jiàn)小編之前的文章《免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗體藥總結(jié)》。

• 免疫抑制細(xì)胞因子與免疫抑制分子。腫瘤或者巨噬細(xì)胞會(huì)釋放一些免疫抑制細(xì)胞因子或者免疫抑制分子來(lái)減弱局部的抗腫瘤免疫反應(yīng)。TGF-β能夠促進(jìn)血管生成，刺激Tregs從而發(fā)揮免疫抑制作用。在多種腫瘤中，高水平的TGF-β都伴隨著極差的預(yù)后。臨床前實(shí)驗(yàn)使用TGF-β受體激酶抑制劑與anti-CTLA-4聯(lián)用，或者放療與TGF-β抑制劑都顯示出了較好的腫瘤抑制效果。在細(xì)胞外，CD39能夠?qū)TP水解成AMP，進(jìn)一步被胞外核苷酶CD73加工為免疫抑制分子腺苷adenosine。Adenosine能夠通過(guò)T細(xì)胞上的A2A受體抑制T細(xì)胞的增殖與細(xì)胞毒活性，也能通過(guò)腫瘤細(xì)胞上的A2B受體促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。多種類型的腫瘤中，CD73的高表達(dá)伴隨著較差的預(yù)后，且會(huì)影響anti-PD-1的效果。此外，IFNγ會(huì)促進(jìn)免疫抑制分子IDO的表達(dá)，IDO能直接負(fù)調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞的功能。

• 趨化因子與趨化因子受體。某些特異的趨化因子與趨化因子受體在MDSCs和Tregs往腫瘤微環(huán)境的運(yùn)輸過(guò)程中起到重要作用。腫瘤細(xì)胞能夠分泌配體CCL5，CCL7和CXCL8，通過(guò)結(jié)合MDSCs上表達(dá)的CCR1及CXCR2受體，從而將MDSCs吸引至腫瘤微環(huán)境中。CCR4在Tregs上高表達(dá)，anti-CCR4能夠有效抑制T細(xì)胞的招募并通過(guò)ADCC效應(yīng)減少Tregs的數(shù)目。此外CXCR4是CXCL12的受體，CXCL12能夠通過(guò)影響Tregs定位等多種方式發(fā)揮免疫抑制作用。

• 腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞上CD28的表達(dá)。CD28是T細(xì)胞的共刺激分子，對(duì)于T細(xì)胞的激活，增殖和存活起到關(guān)鍵作用。在人出生時(shí)，所有T細(xì)胞都會(huì)表達(dá)CD28，但是CD28的表達(dá)量會(huì)隨著年齡的增加而下降，80歲時(shí)會(huì)有10-15%的CD4+ T細(xì)胞以及50-60%的CD8+ T細(xì)胞缺失CD28表達(dá)。CD28-T細(xì)胞產(chǎn)生的主要原因是重復(fù)的抗原刺激。CD28表達(dá)的消失只存在與人和靈長(zhǎng)動(dòng)物中，在鼠中并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。在今年3月9日的《Science》上，發(fā)表了來(lái)自Emory疫苗中心的研究工作，他們發(fā)現(xiàn)CD28對(duì)于耗盡的CD8+T細(xì)胞(Exhausted CD8+ T Cell)的再激活是必須的。在老鼠模型中，阻斷CD28-B7共刺激通路，會(huì)影響腫瘤特異CD8+T細(xì)胞的增殖和激活，降低對(duì)anti-PD-1/PD-L1療法的響應(yīng)。在經(jīng)過(guò)anti-PD-1治療的NSCLC病人中，增殖的CD8+T細(xì)胞(高Ki-67表達(dá))大都為PD-1陽(yáng)性，且被激活(高HLA-DR，CD38表達(dá))。和鼠模型中一樣，這些增殖的CD8+T細(xì)胞大都是CD28陽(yáng)性的，說(shuō)明了CD28共刺激對(duì)于腫瘤浸潤(rùn)的PD-1+CD8+T細(xì)胞的增殖與再激活是至關(guān)重要的。因此，CD28可以用作預(yù)測(cè)anti-PD-1療法響應(yīng)程度的分子標(biāo)記。

獲得性耐藥的產(chǎn)生原因

腫瘤免疫療法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是腫瘤響應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)，但是在使用anti-CTLA-4或anti-PD-1治療黑色素瘤的患者中，大約有1/4-1/3的患者在經(jīng)歷初始響應(yīng)后出現(xiàn)了腫瘤進(jìn)展，即獲得性耐藥。獲得性耐藥的產(chǎn)生可能是因?yàn)樵谥委熯^(guò)程中出現(xiàn)了上文所述的那些原因，包括T細(xì)胞功能的喪失，腫瘤抗原提呈出現(xiàn)缺陷以及其他一些新突變的產(chǎn)生。例如，在一類較晚獲得anti-PD-1耐藥性的病人中，發(fā)現(xiàn)了B2M的突變，從而導(dǎo)致抗原提呈機(jī)制缺陷。在另兩例獲得性耐藥腫瘤中，發(fā)現(xiàn)了IFNγ通路中JAK1或JAK2發(fā)生了突變。

在2016年《nature communication》上，有研究者發(fā)現(xiàn)anti-PD-1耐藥性的產(chǎn)生與抑制性免疫檢查點(diǎn)TIM-3的的表達(dá)量升高密切相關(guān)。在兩個(gè)老鼠腫瘤模型中，耐藥后與給藥前相比，腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞而非外周血或脾臟T細(xì)胞上的TIM-3表達(dá)量顯著上調(diào)，且TIM-3表達(dá)量上調(diào)的主要是那些結(jié)合了anti-PD-1抗體的T細(xì)胞。需注意的是TIM-3表達(dá)量升高是anti-PD-1療法特異的，因?yàn)閍nti-CTLA-4中并未檢測(cè)到類似現(xiàn)象。此外，腫瘤細(xì)胞上TIM-3配體Galectin-9的表達(dá)量也顯著升高。當(dāng)anti-PD-1療法出現(xiàn)耐藥后，聯(lián)用anti-TIM-3，顯著提高了生存率。有意思的是，當(dāng)anti-PD-1和anti-TIM-3聯(lián)用被耐藥，腫瘤重新進(jìn)展時(shí)，那些結(jié)合了anti-PD-1和anti-TIM-3抗體的T細(xì)胞上，其他的抑制性免疫檢查點(diǎn)如CTLA-4，LAG-3的表達(dá)量明顯升高。這說(shuō)明了腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的抑制性免疫調(diào)節(jié)是動(dòng)態(tài)變化的，存在著補(bǔ)償效應(yīng)。最后，在兩例對(duì)anti-PD-1療法獲得性耐藥的NSCLC病人腫瘤樣本中，也觀察到了TIM-3而非其他抑制性免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)量顯著升高。這些結(jié)果說(shuō)明了anti-PD-1和anti-TIM-3聯(lián)用是對(duì)于那些anti-PD-1療法獲得性耐藥病人的一個(gè)良好策略。

▲      Anti-TIM-3與anti-PD-1聯(lián)用能顯著抑制腫瘤進(jìn)展

應(yīng)對(duì)腫瘤免疫耐藥的方案

 隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的概念深入人心，鑒定出有效的生物標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)免疫療法的響應(yīng)與耐藥非常有意義。這些生物標(biāo)記包括基因組標(biāo)記，免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá)量以及浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的密度和分布等免疫標(biāo)記。相對(duì)于之前使用的治療前本底水平的生物活檢(pre-treatment baseline biopsies)，縱向的多次活檢(longitudinal biopsies)可能會(huì)更好地預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)治療的響應(yīng)。最近研究表明相比于治療前的標(biāo)記，治療早期樣本的免疫標(biāo)記有更好地預(yù)測(cè)效果。

此外，應(yīng)對(duì)腫瘤免疫耐藥的一個(gè)有效方法就是聯(lián)合用藥。Anti-PD-1與anti-CTLA-4聯(lián)合用藥治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤顯示出了更高的響應(yīng)率。Anti-PD1與anti-TIM-3/anti-LAG-3/anti-TIGIT的聯(lián)合用藥在臨床前實(shí)驗(yàn)都展示出了極佳的效果，臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中。除了免疫檢查點(diǎn)抑制劑之間聯(lián)用，免疫檢查點(diǎn)抑制劑與共刺激因子激動(dòng)劑，靶向藥，放療化療以及表觀遺傳修飾因子的聯(lián)用都在探索之中。希望未來(lái)免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠聯(lián)合一些便宜的非專利藥，來(lái)減少聯(lián)合用藥帶來(lái)的高花費(fèi)。

▲      腫瘤免疫治療的聯(lián)用方案

結(jié)語(yǔ)

腫瘤免疫治療改變了腫瘤治療的格局，但是其耐藥性限制了它的療效與應(yīng)用。希望在接下來(lái)的幾年里能開(kāi)發(fā)出合適的生物標(biāo)記來(lái)指導(dǎo)個(gè)性化用藥，從而提高免疫治療的響應(yīng)。此外，通過(guò)聯(lián)合用藥，減少原發(fā)性耐藥帶來(lái)的副作用，提高免疫治療的響應(yīng)率，爭(zhēng)取在一些anti-PD-1單一療法不起作用的癌癥類型，如胰腺癌和前列腺癌上取得成功。

參考文獻(xiàn)

• Primary, Adaptive, and Acquired Resistance to Cancer Immunotherapy

• Resistance to PD1/PDL1 checkpoint inhibition.

• Rescue of exhausted CD8 T cells by PD-1-targeted therapies is CD28-dependent.

• Adaptiver esistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints.