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研究蛋白與蛋白的相互作用的方法有拉下實(shí)驗(yàn)（pull-down）、coIP (immunoprecipitation, 免疫沉淀)； 研究蛋白與RNA相互作用的方法有RIP（RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）； 研究蛋白與DNA相互作用的方法有CHIP（染色質(zhì)chromatin免疫共沉淀）。 以上幾種研究方法共用一個(gè)原理——免疫沉淀。即，抗原蛋白A與B(蛋白、RNA、DNA)相互作用，使用bead結(jié)合抗體A，把抗原A沉淀下來(lái)，然后在沉淀中檢測(cè)B的存在。 coIP和pull-down比較簡(jiǎn)單，直接用抗體B檢測(cè)沉淀物即可，而RIP和CHIP則要用檢測(cè)RNA和DNA的方法，測(cè)序或者PCR，今天介紹CHIP。 CHIP 什么蛋白與DNA相互作用？ （1）組蛋白，結(jié)合牢固，很好檢測(cè)； （2）轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合較松散，檢測(cè)有難度； （3）輔助轉(zhuǎn)錄因子，很難檢測(cè)，檢測(cè)位點(diǎn)經(jīng)常被掩蓋。 實(shí)驗(yàn)流程 CST有兩款CHIP試劑盒，一種酶解法，一種超聲法，主要的區(qū)別在于染色質(zhì)片段化的處理過程，一種主要用酶，一種主要用超聲；酶解法更穩(wěn)定，適合小白，超聲法，有經(jīng)驗(yàn)者，結(jié)果更好。 預(yù)實(shí)驗(yàn)摸好條件后，嚴(yán)格按照protocol來(lái)，即可。 CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響因素 （1）樣品 a，單組實(shí)驗(yàn)最少要有400萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，DNA濃度可達(dá)到100ng左右；還有陰性、陽(yáng)性對(duì)照兩組； b，甲醛處理時(shí)間要合適，不同細(xì)胞需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索； c，酶消化和超聲處理，要使DNA處理到150-500bp最佳，預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，這部很關(guān)鍵。 （2）免疫沉淀過程 嚴(yán)格按照protocol，主要是抗體選擇，說(shuō)明可以做CHIP的抗體，如果是測(cè)序分析DNA，還要選擇測(cè)序級(jí)別的抗體；濃度1：100-200一般為最佳； （3）DNA分析 qPCR是很好的方法檢測(cè)可能的結(jié)合位點(diǎn)； 引物設(shè)計(jì)主要在啟動(dòng)子區(qū)域，一般針對(duì)基因前100-500bp，設(shè)計(jì)涵蓋啟動(dòng)子區(qū)域的多個(gè)引物，常用的軟件有MEME、ECRBrowser。 CHIP用時(shí)較久，一般要3天，中間步驟復(fù)雜，得到好的結(jié)果不容易，需要反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)。 |
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