本文主要根據(jù)期刊文章《Mitra等（2020）Regulatory Toxicology and Pharmacology, 117 以非臨床安全性評估的觀點探討治療性多肽產(chǎn)品的開發(fā)》、及《Ypsilanti（2018）Health Sciences Eastern Michigan University, 有關(guān)合成肽臨床前測試的法規(guī)問題》整理而成。

多肽是一類獨特的藥物，也是全球醫(yī)藥的重要治療方法。自1920年全世界第一個多肽胰島素被發(fā)現(xiàn)，其后的產(chǎn)品包括激素替代品（胰島素和促腎上腺皮質(zhì)激素）、天然來源分離出的抗菌素（桿菌肽，短桿菌肽D和多粘菌素B）被陸續(xù)開發(fā)出來。

從1970年代開始，合成激素類似物（莎拉欣，去氨加壓素和促性腺激素）成為治療性多肽產(chǎn)業(yè)的主要關(guān)注點，而如今，重組技術(shù)已用于制造激素替代品（甲狀旁腺激素和胰高血糖素）和類似物（杜拉魯肽，胰島素類似物和 Teduglutide），可用于眾多治療領(lǐng)域。截至2021年已有100多種肽被批準(zhǔn)用于人類。通常，多肽是化學(xué)合成的，是來源于細(xì)胞并由生物技術(shù)衍生的，或者是從天然產(chǎn)物中分離出來的，然后通過向重組產(chǎn)物中添加脂質(zhì)結(jié)合物或通過對天然衍生產(chǎn)物的化學(xué)修飾。

多肽類藥物涵蓋眾多不同種類的多肽分子，并以多種方式制造，也包括非多肽類的修飾（non-peptide modifications）。盡管多肽藥物的確切定義是一個有爭議的問題，但基于多肽的療法，多肽長度的范圍可以從3到100個氨基酸（amino acids,AA）。

多肽藥物結(jié)構(gòu)上介于小分子和蛋白質(zhì)之間，具有高特異性和低毒性的獨特優(yōu)勢。在鑒定與疾病發(fā)病機(jī)理有關(guān)的新受體和靶標(biāo)方面，獨特且有價值的完整的多肽全庫結(jié)合高通量篩選（HTS）的技術(shù)已被成功的發(fā)展出，此技術(shù)對多肽的篩選發(fā)現(xiàn)苗頭化合物用于治療疾病上邁出重要的一步。

然而，某些多肽內(nèi)在特性，例如代謝不穩(wěn)定和需要腸胃外給藥途徑，是多肽藥物開發(fā)及成藥性的主要障礙。以上的這些障礙可以用化學(xué)合成的多肽通過使用非蛋白氨基酸（non-proteogenic amino acids）改善代謝穩(wěn)定性來克服這些挑戰(zhàn)，或者使用化學(xué)藥品（例如聚乙二醇, PEG）增強(qiáng)穿膜運輸。

此外，多肽開發(fā)的最具挑戰(zhàn)性的階段是臨床前階段。由于多肽不能像小分子那樣通過擴(kuò)散到達(dá)細(xì)胞靶標(biāo)，亦不能通過細(xì)胞膜后，直接與胞內(nèi)受體結(jié)合而發(fā)揮作用，因此通過體外和體內(nèi)試驗來確定其藥理和藥代動力學(xué)試驗極具有挑戰(zhàn)性。

與任何其他生物技術(shù)一樣，多肽的開發(fā)和安全性評估也面臨著各種復(fù)雜的挑戰(zhàn)。其中包括在多肽療法的開發(fā)過程中，缺乏監(jiān)管法規(guī)導(dǎo)致了幾個問題。這些問題包括但不限于–在開發(fā)化學(xué)合成的與生物技術(shù)衍生的肽時需要遵循的監(jiān)管法規(guī)、毒理學(xué)實驗動物模型選擇的策略、遺傳毒性和免疫原性評估是否具有附加價值，是否需要對含有非蛋白氨基酸的肽進(jìn)行額外的毒理學(xué)研究。

因為全球缺乏針對多肽開發(fā)的具體醫(yī)事注冊監(jiān)管法規(guī)，該類藥物的非臨床安全性評估只能主要依賴于將現(xiàn)有的小分子藥物[國際協(xié)調(diào)聯(lián)盟 ICH S1-S5, S7-S8, M3 (R2)]和生物制藥的 [ICH S6 (R1)]醫(yī)事注冊監(jiān)管指導(dǎo)法規(guī)，但是針對多肽的指導(dǎo)法規(guī)仍然有限。

先前的美國食品藥品監(jiān)督管理局(US FDA)注冊法規(guī)指出，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)和多肽產(chǎn)品，除抗生素和激素產(chǎn)品外，均應(yīng)作為生物制劑進(jìn)行審查。FDA CDER部門審查了當(dāng)前數(shù)據(jù)集中的絕大多數(shù)肽。唯一的例外是Fc或白蛋白融合物（阿比魯肽，杜拉魯肽，romiplostim），阿卡侖肽，新型60AA重組激肽釋放酶抑制劑和甲狀旁腺激素（84 AA），因為它們被認(rèn)為是激素產(chǎn)品。

FDA在2020年3月更改了多肽類藥物的分類，當(dāng)時生物制劑價格競爭和創(chuàng)新（BPCI) 法案正式宣布，大于40AA的重組分子，無論其藥理學(xué)如何，都將被視為蛋白質(zhì)生物制劑，而無論生產(chǎn)方法的所有小于 40 AA 多肽類，都將遵循新藥申請 (NDA) 途徑。

本報告的借由1998年至2019年在美國治療性多肽產(chǎn)品獲得批準(zhǔn)摘要 (Summary basis of approval, SBA) 分析，包括總共47種多肽外，有49％ 是化學(xué)合成的，有40％是通過生物技術(shù)合成的，有13％是半合成制造的，1％ 是從天然來源獲得的。

為了深入了解治療性多肽的醫(yī)事注冊法規(guī)要求，在治療性多肽產(chǎn)品批準(zhǔn)摘要分析下，發(fā)現(xiàn)其研發(fā)模式，遵循的醫(yī)事注冊監(jiān)管法規(guī)以及毒理學(xué)實驗動物模型選擇的策略，其中包括：遺傳毒性和免疫原性評估的要求，雜質(zhì)、代謝物和安全藥理學(xué)評估，含有非蛋白氨基酸（NPAA）的多肽的安全性和安全性評估。其非臨床毒理學(xué)發(fā)展策略如下:

一般毒理學(xué)

根據(jù)當(dāng)前ICH指導(dǎo)法規(guī)的措辭，化學(xué)合成和生物技術(shù)衍生的多肽似乎屬于 ICH S6（R1 ）法規(guī)。但是，從獲得批準(zhǔn)治療性多肽產(chǎn)品中可以清楚地看出，實際上多肽藥物總是使用類似ICHM3（R2）的小分子藥物方法開發(fā)的。這包括在嚙齒動物和非嚙齒動物物種中進(jìn)行一般毒性研究，基于最大耐受劑量（MTD）設(shè)置高劑量的非臨床毒理學(xué)研究 (包括之后評估遺傳毒性、發(fā)育毒性和生殖毒性)，而不是考慮效價、結(jié)合親和力、靶標(biāo)結(jié)合和/或受體占有率 (RO）。

雖然ICH M3（R2）醫(yī)事注冊指導(dǎo)法規(guī)明確指出治療性多肽產(chǎn)品在本法規(guī)的范圍之外，而ICH S6（R1）指導(dǎo)法規(guī)建議在該法規(guī)的原則下開發(fā)化學(xué)合成或重組的多肽藥物。但是，獲得批準(zhǔn)治療性多肽產(chǎn)品不管采用何種多肽合成方法，大多數(shù)均按照ICH M3（R2）指導(dǎo)法規(guī)，在所有肽的嚙齒動物 (大鼠) 和非嚙齒類動物 （狗或食蟹猴）中進(jìn)行了常規(guī)毒理學(xué)研究，在研究中探索并提供的最高劑量是基于最大耐受劑量或極限劑量。

通常，慢性毒理學(xué)研究的持續(xù)時間遵循ICH S4的指導(dǎo)。嚙齒類動物研究通常持續(xù)時間為≥6個月，同樣的非嚙齒類動物研究也持續(xù)時間為≥9個月，若急性或較短的臨床給藥方案可以選用持續(xù)時間較短的慢性毒理學(xué)研究。

發(fā)育和生殖毒理學(xué) (DART)

由于治療性多肽藥物可作為激素的類似物或拮抗劑，加上激素在許多情況下是生殖發(fā)展和胎兒發(fā)育過程所必需的，因此發(fā)育和生殖毒理學(xué)研究被認(rèn)為對治療性多肽藥物的安全評估是事關(guān)重要的。所以針對所有治療性多肽藥物應(yīng)該進(jìn)行了 Seg I 嚙齒動物的生殖毒理研究，Seg II 嚙齒動物和兔子的胚胎-胎兒發(fā)育的生殖毒理研究以及Seg III 嚙齒動物的產(chǎn)前和產(chǎn)后發(fā)育的生殖毒理研究。

此外，生殖毒理學(xué)還對治療性多肽藥物進(jìn)行了幼體毒性研究。根據(jù) ICH S6（R1）注冊指導(dǎo)法規(guī)，生物制藥要求在非人類靈長類 (NHP) 動物中進(jìn)行主要生殖毒理學(xué)研究。但是在獲得批準(zhǔn)重組多肽藥物注冊審批過程中發(fā)現(xiàn)，在生殖毒理學(xué)實驗上，醫(yī)事注冊監(jiān)管機(jī)構(gòu)尚無對多肽藥物藥理學(xué)相關(guān)實驗動物模型的選擇做進(jìn)一步的討論。

多肽藥物含有非蛋白氨基酸

非蛋白氨基酸可以是天然存在（例如肌氨酸，鳥氨酸或D-丙氨酸），也可以是非天然存在（例如1-萘基丙氨酸，4-氯-D-苯丙氨酸或芐基酪氨酸）。在多肽藥物中，為了改善多肽對靶標(biāo)結(jié)合親和力或穩(wěn)定性，非蛋白氨基酸通常加入多肽中。

在1998年后獲得批準(zhǔn)的47種多肽藥物中，有45％至少包含一種非蛋白氨基酸，其中有17％至少包含一種非天然的非蛋白氨基酸，而且這些多肽制劑大多數(shù)具有包含一個以上的非蛋白氨基酸。

從理論上講，該多肽一旦被代謝就可以釋放出非蛋白氨基酸，然后可以將其摻入體內(nèi)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)中。當(dāng)非蛋白氨基酸存在于肽治療劑的結(jié)構(gòu)中時，即使這些非蛋白氨基酸沒有使用先例，醫(yī)事注冊監(jiān)管機(jī)構(gòu)也未要求進(jìn)行其他毒理學(xué)研究。唯一的例外是非蛋白氨基酸也以雜質(zhì)形式存在于原料藥或藥品中。

所以對于絕大多數(shù)的（天然或非天然）非蛋白氨基酸，即使在以前批準(zhǔn)的多肽藥物在從未使用過非蛋白氨基酸的情況下，極為罕見對于獨立的非蛋白氨基酸進(jìn)行專門的遺傳或一般毒理學(xué)研究。

在兩個獲得批準(zhǔn)多肽藥物中，醫(yī)事注冊監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求申辦方的對聯(lián)氨苯吡啶多肽藥物 (bivaluridine) 必須在大鼠中進(jìn)行了急性和重復(fù)劑量毒性研究，因為其中有2種非蛋白氨基酸原料藥（DS）以的雜質(zhì)形式存在。

對于依卡替班多肽藥物 (icatibant)，在2種非蛋白氨基酸原料藥中發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)情況下，醫(yī)事注冊監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求申辦方進(jìn)行了單劑量體內(nèi)毒理學(xué)研究和遺傳毒理學(xué)研究 (細(xì)菌反向突變試, Ames test)。

免疫原性 (ADA) 評估

化學(xué)合成和重組的多肽治療劑，就像蛋白質(zhì)一樣，具有誘導(dǎo)人類免疫原性應(yīng)答的潛力。如果多肽藥物基于任何內(nèi)源性蛋白質(zhì)中都不存在的 AA 序列的話，則抗藥物抗體 （ADA） 的產(chǎn)生會導(dǎo)致功效喪失和清除率改變。在大多數(shù)情況下，這將意味著增加劑量水平或改用其他藥物。

但是，當(dāng)多肽藥物是內(nèi)源蛋白質(zhì)的類似物或與內(nèi)源蛋白質(zhì)的序列有明顯重疊時， ADA 抗體的產(chǎn)生可能意味著針對此類內(nèi)源蛋白質(zhì)的抗體，若這一個問題存在的話，這將是一個重大的安全問題。

在 1998 年后獲得批準(zhǔn)多肽藥物中，有 67％ 多肽藥物在非臨床或臨床研究中有評估ADA。評估了免疫原性的多肽藥物中，在非臨床、臨床研究中分別有 62％、87％ 的 ADA 呈陽性，但非臨床 ADA 測試在預(yù)測臨床 ADA 陽性結(jié)果敏感度的僅為 72％。

在過去的十年中， ADA 測定的靈敏度以及在血清中存在過量藥物的情況下測量 ADA 的方法已有所改善，因此， 2007 年后幾乎測試的每種多肽藥物的 ADA 都成呈陽性反應(yīng)。產(chǎn)生 ADA 的多肽藥物氨基酸長度范圍為 8 到 84。

另外，在臨床上具有 ADA 陽性的多肽藥物中，大多數(shù) （66％） 不包含非蛋白氨基酸。這表明多肽藥物的氨基酸長度和非蛋白氨基酸的存在均未對其免疫原性產(chǎn)生明顯影響。在臨床上對 ADA 測試呈陽性的藥物中，有 90％ 的病例沒有對藥物的藥代動力學(xué) （PK） 或?qū)λ幮Мa(chǎn)生影響。

盡管尚未建立 ADA 測試在非臨床物種中與臨床反應(yīng)的相關(guān)性，但在藥物顯示非臨床 ADA 呈陽性的所有情況下，它在臨床中也大都會呈 ADA 陽性。在臨床上對 ADA 進(jìn)行非臨床評估的藥物中，有 72％ 的抗藥物抗體陽性，而在臨床中 87％ 的 ADA 藥物呈陽性，這表明肽類藥物產(chǎn)生抗體的傾向很高。

但是，在臨床上已觀察到 ADA 陽性反應(yīng)的90％的病例中，未觀察到對 PK 或功效的影響，即使在 ADA 影響藥效學(xué)讀數(shù)的兩種情況下，在臨床試驗中也僅占受試者的一小部分，這似乎并不是一個重大的安全隱患。但仍建議在多肽藥物的開發(fā)使用相關(guān)且靈敏的檢測方法來監(jiān)控 ADA 的形成。

雜質(zhì)鑒定

根據(jù)現(xiàn)有醫(yī)事注冊監(jiān)管指導(dǎo)法規(guī)，多肽藥物質(zhì)量檢查標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)在小分子藥物 [ICH Q3A (R2) 和ICH Q3B (R2)] 指導(dǎo)法規(guī)、或依據(jù)生物制藥指導(dǎo)法規(guī) （ICH Q6B）有關(guān)原料藥及藥物中雜質(zhì)和降解物的標(biāo)準(zhǔn)，尚未定論。

多肽藥物申辦方對化學(xué)和半合成生產(chǎn)的 57％ 多肽中進(jìn)行了獨立的雜質(zhì)和降解物鑒定研究。其中包括體外遺傳毒性試驗以及使用“加標(biāo)”或降解批次的一般毒性研究。

對于依卡替班多肽藥物，申辦方被要求按照基于多肽雜質(zhì)的鑒定和鑒定閾值進(jìn)行 3 個月的雜質(zhì)鑒定研究，而不是 ICH 雜質(zhì)鑒定指南文件中提到的傳統(tǒng)閾值。所以，建議未來多肽重組藥物可能需要降解物鑒定研究。例如，對于胰島素地高盧德和德特米爾胰島素，對此類型的多肽藥物進(jìn)行了為期 1 個月的大鼠降解資格研究。

因為缺乏關(guān)于多肽藥物雜質(zhì)的明確指導(dǎo)法規(guī)，并且在 ICH Q3A（R2）法規(guī)特別標(biāo)明多肽類不在管轄范圍之內(nèi)。盡管與多肽藥物工藝有關(guān)的小分子雜質(zhì)，可能存在于合成或半合成肽中，但這些雜質(zhì)通?？梢酝ㄟ^現(xiàn)代制造技術(shù)輕松控制。

相比之下，在多肽合成過程產(chǎn)生的多肽相關(guān)的雜質(zhì)更是一個問題，由于它們與藥物本身結(jié)構(gòu)相似，以及與傳統(tǒng)的小分子相比較大的，相對復(fù)雜的肽分子結(jié)構(gòu)，所以這些與多肽的雜質(zhì)難以檢測、定量和控制。

重組肽可以使用類似 ICH Q6B 指導(dǎo)法規(guī)的方法將這些雜質(zhì)作為產(chǎn)物異質(zhì)性處理，但是化學(xué)合成的肽很可能包含相似的異質(zhì)性，同時仍保留了傳統(tǒng)的以小分子為重點的雜質(zhì)指導(dǎo)原則。在這種情況下，需要采取更加細(xì)致和靈活的方法來處理多肽藥物的雜質(zhì)問題。

生物轉(zhuǎn)化和藥代動力學(xué)評估

對所有化學(xué)合成和半合成多肽藥物進(jìn)行了詳細(xì)的生物轉(zhuǎn)化研究，這些研究包括多肽藥物體外代謝和活性的研究、代謝物的結(jié)構(gòu)表征以及體內(nèi)代謝動力學(xué)和毒理學(xué)研究中代謝物的定量研究。其中僅對幾種重組多肽藥物采用了甘精胰島素和甘精胰島素的放射性標(biāo)記多肽，進(jìn)行非臨床體內(nèi)代謝物分析。

此外，這些人類多肽代謝物水平皆低于在非臨床實驗動物的水平，所以沒有進(jìn)行任何多肽獨立的代謝物安全性評估研究。并且 ICH S6（R1） 法規(guī)特別指出，生物技術(shù)來源的藥物會降解為小肽和單個 AA，因此，其代謝途徑都充分被理解，因此認(rèn)為其生物轉(zhuǎn)化研究不是必需的。

除了一個例外情況 ，若多肽主要代謝物會影響到藥理反應(yīng)，建議執(zhí)行非臨床和臨床研究中對其進(jìn)行主要代謝物的定量分析，以了解其對藥物藥理學(xué)的影響。

遺傳毒性評估

根據(jù) ICH S6（R1） 法規(guī)，重組產(chǎn)品無需進(jìn)行基因毒性評估，因為重組產(chǎn)品不會直接與 DNA 或其他染色體材料發(fā)生相互作用。但是在 1998 年后獲得批準(zhǔn)多肽藥物中，對所有化學(xué)合成、半合成衍生和天然多肽藥物進(jìn)行了完整標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性評估（包括體外細(xì)菌 Ames 以及體內(nèi)和體外染色體畸變測試）。

因此，對于為什么對重組多肽藥物進(jìn)行遺傳毒性評估，原因尚不清楚。在獲得批準(zhǔn)的多肽藥物中，無論用何種方法合成的多肽藥物，都對大多數(shù)多肽（包括重組肽）進(jìn)行了遺傳毒性評估，最終的結(jié)果判定為沒有遺傳毒性。

另一種可能的情況是，當(dāng)使用 Ames 分析法來評估化學(xué)合成或半合成多肽藥物時，因為多肽合成過程所產(chǎn)生的雜質(zhì)可能會產(chǎn)生潛在的遺傳毒理反應(yīng)。

光毒性評估

多肽藥物的光毒性評估是使用在 3T3 中性紅吸收試驗，對多肽進(jìn)行光毒性潛能的體外評估。但是，歐洲醫(yī)學(xué)協(xié)會實驗指出多肽藥物具有一些紫外線吸收的趨勢（通常在 280 nm處出現(xiàn)峰，在 290 nm 處出現(xiàn)肩峰）。

因為多肽中的芳香族氨基酸可作為生色團(tuán)。這與任何光毒性無關(guān)，并且通常不需要對多肽藥物進(jìn)行光安全性測試。此外，根據(jù) ICH S10法規(guī)，多肽藥物不在法規(guī)適用的范圍。因此，不建議多肽藥物治療劑進(jìn)行光毒性評估。

安全藥理學(xué)

在ICH S6（R1）和ICH S7A＆B法規(guī)中提供了有關(guān)生物制劑和小分子藥物的具體指南。但是多肽藥物的在安全藥理試驗的評估中，沒有具體法規(guī)規(guī)定多肽藥物必須進(jìn)行 hERG 抑制作用測試和進(jìn)行全面QT評估。

在1998 年后獲得批準(zhǔn)的多肽藥物中，發(fā)現(xiàn)NDA中提交的49％多肽藥物執(zhí)行 hERG 分析評估，于2005年在ICH S7B法規(guī)發(fā)布后，所提交的69％獲得批準(zhǔn)的多肽藥物中，包含特定的 hERG分析。當(dāng)前不建議對在生物許可證申請 (BLA) 下提交的多肽藥物進(jìn)行 hERG分析。

有趣的是，作為BLA提交的67％的多肽藥物，在其數(shù)據(jù)包中包含了hERG分析。在心血管安全藥理研究中，無論以 NDA 還是 BLA 形式提交的多肽藥物，所提交的40％獲得批準(zhǔn)的多肽藥物中，使用大鼠、狗或非人類靈長類動物進(jìn)行的心血管安全藥理研究。

但多肽藥物中只有不到一半是在臨床全面 QT 研究中進(jìn)行評估的，尚不清楚采用什么標(biāo)準(zhǔn)來納入或省略這些研究。目前為止已批準(zhǔn)的多肽藥物中，尚未發(fā)現(xiàn)具有確定的 QT 間隔延長的多肽藥物。

致癌性評估

根據(jù)ICH S1法規(guī)，致癌性評估必要在兩種非臨床嚙齒動物模型中進(jìn)行多肽藥物試驗。使用了15％和35％獲得批準(zhǔn)的多肽藥物在一種和兩種嚙齒動物中分別進(jìn)行了致癌性研究，由于所有多肽藥物均不具有遺傳毒性，觀察到約 50％ 的致癌性可能是嚙齒動物模型中藥理夸大的結(jié)果。由于多肽藥物本質(zhì)上是沒有遺傳毒性，因此，建議在進(jìn)行致癌性研究之前，應(yīng)先測試嚙齒動物中多肽的藥理活性，并與醫(yī)事注冊監(jiān)管單位進(jìn)行充分溝通。

總之，本寫意報告旨在介紹多肽藥物非臨床安全性測試相關(guān)的醫(yī)事注冊監(jiān)管單位意見，并強(qiáng)調(diào)多肽類藥物監(jiān)管方式的主要差異，以及提供其發(fā)展所需的毒理學(xué)、安全藥理學(xué)和免疫原性評估的期望。

在多肽治療藥物的開發(fā)方面存在很大的歧義，此報告的分析為多肽治療藥物的非臨床開發(fā)提供了一個通用框架，并突顯了醫(yī)事注冊監(jiān)管單位需要針對多肽治療藥物在遺傳毒性、雜質(zhì)、代謝產(chǎn)物和非蛋白氨基酸評估等方面建立特殊法規(guī)。

本報告的另外一個目的是分析獲得批準(zhǔn)的多肽類藥物的非臨床毒理學(xué)發(fā)展范例，提供資訊給中國多肽藥企在美國注冊治療性多肽產(chǎn)品的公認(rèn)法規(guī)要求，以期了解用于支持其多肽類藥物在美國注冊的研究和策略的制定。

參與文獻(xiàn)