原名：Integrativemetagenomic and metabolomic analyses reveal severity-specific signatures of gutmicrobiota in chronic kidney disease

譯名：整合宏基因組和代謝組學分析揭示了不同嚴重程度的慢性腎臟疾病中腸道微生物特征

期刊：Theranostics

影響因子：8.063

發(fā)表日期：2020.04.06

通訊作者：臺灣長庚大學

作者單位：Shih-ChiSu

慢性腎臟疾病(CKD)通常與代謝和心血管并發(fā)癥相關，對社會造成嚴重的醫(yī)療負擔。許多危險因素，包括年齡、性別、遺傳、接觸重金屬、吸煙、過度飲酒、病毒感染、肥胖、高血壓和糖尿病，已被證明是相互關聯(lián)的，并且對于評估CKD預后和影響其發(fā)展為終末期腎病(ESRD)是必要的。如此復雜的病因增加了疾病的臨床異質(zhì)性，識別可操作的CKD易感因素以阻止疾病進展到終末期腎病(ESRD)，刻不容緩。

證據(jù)表明CKD和ESRD的發(fā)生發(fā)展與腸道微生物的組成和功能有關。雖然暫時沒有定論，但與正常對照組相比，ESRD患者的腸道菌群結構改變，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌）, Actinobacteria（放線菌）和Proteobacteria（變形桿菌）顯著富集，雙歧桿菌和乳桿菌豐度減少。值得注意的是，菌群對腸道環(huán)境變化的不適應可以在疾病早期階段被檢測到。這種腸道生物失調(diào)，加上腸道屏障功能受損，通過調(diào)節(jié)細菌移位以及循環(huán)中存在內(nèi)毒素和其他有毒產(chǎn)物，決定了CKD的整體炎癥狀態(tài)。除了調(diào)節(jié)宿主免疫外，腸道細菌還通過產(chǎn)生飲食衍生的生物活性代謝物來發(fā)揮內(nèi)分泌器官的作用，這些代謝物可能具有腎毒性或腎臟保護潛力。尤其是，尿毒癥毒素或尿毒癥毒素前體，如三甲胺N-氧化物(TMAO)、硫酸對甲酚(PC)和硫酸吲哚酚(IS)，是腸道微生物營養(yǎng)加工的結果，可能導致腎臟和心血管損害。此外，與CKD患者或動物的各種致病過程有關的微生物營養(yǎng)轉化還包括氫氧化銨、短鏈脂肪酸(SCFAs)和次級膽汁酸。綜上所述，整合宏基因組和代謝組學分析可能有助于通過腸道生態(tài)系統(tǒng)中的相關變化更好地理解CKD的發(fā)展。

盡管基于16S rRNA的測序在醫(yī)學微生物學方面取得了重大進展，但與16S rRNA基因測序相比，深度鳥槍法宏基因組測序對人類微生物群的分類學特征及功能提供了更深入了解。到目前為止，腸道微生物群對慢性腎臟病的研究主要集中在疾病的晚期或早期腎功能下降。在這里，我們利用一種綜合的方法，通過對糞便樣本進行鳥槍法宏基因組測序，并有針對性地對不同嚴重程度的CKD患者和非CKD對照者的血清膽汁酸、SCFA(<6個碳原子)、中鏈脂肪酸(MCFA，6-12個碳原子)和尿毒癥毒素(PC和IS)進行分析，將腸道菌群信息與循環(huán)宿主-微生物共代謝物聯(lián)系起來。我們的雙重組學分析揭示了幾個與循環(huán)代謝物和疾病嚴重程度密切相關的非生物基因/途徑和物種水平分支，這可能具有病因學和診斷意義。

為了探索CKD中腸道微生物與宿主循環(huán)代謝物的關系，我們從92名納入者的橫斷面隊列中收集糞便DNA和血清樣本，包括72例(26例CKD1-2期，26例CKD3期和20例CKD4-5期)和20例非CKD正常對照，進行鳥槍法宏基因組測序和靶向代謝組學分析。由于特定的腸道生物失調(diào)與CKD最常見的兩種合并癥（糖尿病和高血壓）相關，我們納入了腎功能正常、年齡、性別和糖尿病和高血壓狀況相匹配的非CKD對照者(表1)，以排除潛在的混雜因素。血清尿素氮、血肌酐和eGFR反映了各組之間的疾病嚴重程度。

表1：納入人群的基線特點。

為了全面探索與CKD進展相關的腸道微生物群，進行鳥槍法宏基因組測序，執(zhí)行質(zhì)量控制檢查、過濾和宏基因組組裝。我們首先比較了不同組別的腸道微生物多樣性。隨著疾病的嚴重程度，樣本內(nèi)物種豐富度(α多樣性)呈下降趨勢，因為晚期CKD組的物種豐富度顯著低于非CKD對照組(圖1A)。相反，我們在CKD微生物群中觀察到更高的樣本間差異(β多樣性)(圖1B)，表明不同CKD組之間的腸道菌群結構比對照組更不均勻。為更詳細地分析分類學特征，我們將每個CKD嚴重程度組與非CKD對照組進行了比較，并根據(jù)213個物種水平的豐度進行了LEfSe分析?？傮w而言，在至少一個CKD組(圖1C)中，分別有7種物種顯著減少和6種物種顯著增多 (p<0.01)。我們注意到兩種顯著的物種水平變化模式：一種在早期到晚期階段改變(升高或減少)，而另一種僅在特定階段改變。前者的特征是豐度減少的4個物種(Prevotella sp.885, Weissella confuse, Roseburiafaecis, 和 Bacteroideseggerthi)和豐度增加的3個物種(Alloscardoviaomnicolens, Merdibactermassiliensis, 和 Clostridiumglycyrrhizinilyticum)。后者的特征是Cetobacteriumsomerae(輕度CKD)、CandidatusStoquefichus sp. KLE1796(輕度CKD)、Fusobacteriummortiferum  (中度CKD)、Bariatricusmassiliensis (中度CKD)、Bacteroidesstercorirosoris  (中度CKD)和Merdimonasfaecis(重度CKD)。進一步分析表明，Prevotella sp.885 豐度的下降與我們隊列的尿中尿素排泄相關(圖1D)，暗示腸-腎軸在腎損害中的作用。

為了檢測CKD嚴重程度的變化，我們對11種飽和脂肪酸、26種膽汁酸和2種尿毒癥毒素(IS和PC)進行了有針對性的代謝譜分析。與非CKD對照組相比，至少有一個CKD組的4種脂肪酸(癸酸、己酸、丙酸和庚酸)顯著降低(p<0.01)，晚期CKD的兩種腎毒素(IS和PC)顯著升高(圖2A)。己酸和PC水平分別與腎小球濾過率呈正相關和負相關(圖2B)。此外，在慢性腎臟病的晚期，注意到兩種膽汁酸(甘氨酸脫氧膽酸和甘鵝脫氧膽酸)和三種脂肪酸(戊酸、乙酸和辛酸)的輕度下降但具有顯著性意義。 

在CKD進展過程中，微生物與代謝物之間的機械關系受到干擾，為了研究特定的腸道微生物是否參與其中，我們對213個物種與循環(huán)代謝產(chǎn)物的關聯(lián)進行了評估。我們確定了一組與PC水平呈正相關的物種(圖3)，其中許多物種在FEfSe或隨機效應模型分析中被鑒定為生物標記物，表明這種關聯(lián)可能參與了CKD的發(fā)病機制。

雖然不具有統(tǒng)計學意義，但總的來說這些PC相關腸道微生物的豐度與檢測到的許多次級膽汁酸水平呈正相關，而與許多初級膽汁酸、SCFA和MCFA的水平呈負相關，暗示這些脂肪酸和膽汁酸與腎功能有關。值得注意的是，Alistipes obesi和Gordonibacter pamelaeae與PC水平呈正相關，而與顯著降低的MCFA、癸酸水平呈負相關。這些結果揭示了CKD進展中的宿主-微生物-代謝物網(wǎng)絡。

我們接下來研究了不同嚴重程度的CKD組間腸道微生物組的功能。通過將我們的細菌基因目錄映射到KEGG數(shù)據(jù)庫，我們獲得了7513個KEGG同源基因(KO)，存在于至少五個樣本中，用于后續(xù)分析。我們將重點放在與飲食代謝相關的5條途徑上，與非CKD對照相比，總共確定了25個差異富集的KEGG模塊(圖4A)，其中大多數(shù)是在晚期檢測到的(12個病例富集和10個對照富集)。在CKD微生物群中，與類固醇生物合成、醚類脂肪代謝和多不飽和脂肪酸代謝等脂質(zhì)代謝相關的基因在CKD組微生物群中富集，而與碳水化合物和氨基酸代謝相關的基因在對照組中更為富集。值得注意的是，參與脂多糖(LPS)生物合成的基因在晚期病例中富集，提示炎癥反應的升高可能促進CKD發(fā)展。此外，與次級膽汁酸生物合成相關的基因在早期階段差異富集，表明腸道微生物將初級膽汁酸轉化為次級膽汁酸在早期腎功能下降過程中發(fā)生。

因關注誘導宿主炎癥和腎毒性代謝物，我們檢測了微生物基因豐度，以驗證微生物在選定的生物失調(diào)模塊中的作用，如LPS生物合成、次級膽汁酸生物合成和酪氨酸代謝(圖4B)。我們注意到，負責LPS核心低聚糖生物合成的基因豐度在CKD進展過程中發(fā)生了變化(圖4C)。具體地說，在CKD終末期，編碼修飾核心骨架的酶(WaaP，WaaQ)的基因豐富，而編碼構成核心骨架的糖基轉移酶(WaaC，WaaF)的基因減少，這表明在CKD的生理病理中LPS的穩(wěn)定性和結構發(fā)生了變化。此外，我們還觀察到CKD微生物群中與初級(鵝去氧膽酸)轉化為次級膽汁酸相關的基因豐度升高。值得注意的是，升高的基因(K00076，hdhA)的豐度與中間代謝產(chǎn)物熊去氧膽酸的血清水平顯著相關，突出了腸道微生物群在CKD患者血清膽汁酸升高中的作用。對于酪氨酸代謝(晚期病例的富集模塊)，我們發(fā)現(xiàn)晚期基因豐度的變化(tyrB的富集和tpl的缺失)有利于對甲酚的前體4-羥基苯基丙酮酸的產(chǎn)生。這在一定程度上解釋了在腎病終末期觀察到的血清PC水平升高(圖2A)。

對造成這些生物失調(diào)模塊的主要物種進一步分析(圖4D)顯示，LPS生物合成的增強部分歸因于大腸桿菌和腸桿菌科其他物種豐度的增加。其中一個顯著減少的物種蛋類桿菌Bacteroides eggerthii在一定程度上促進了次生膽汁酸的早期合成。這些發(fā)現(xiàn)指出腸道生物失調(diào)及其相關的功能轉變參與調(diào)節(jié)炎癥反應和代謝活動。

為了檢測腸道代謝組和血清代謝組學參數(shù)作為診斷標志物的潛力，我們構建了僅基于物種、僅基于代謝物(排除兩種高度鑒別的尿毒癥毒素，IS和PC)的隨機森林回歸模型，或兩者的組合(圖5A)，以區(qū)分具有不同嚴重程度的CKD和非CKD對照。三種模型之間分類潛力的比較顯示，組合模型在區(qū)分三個CKD嚴重程度組與對照組方面優(yōu)于物種或代謝物純模型，表明通過使用雙重組學，區(qū)分能力有所提高。聯(lián)合模型檢測晚期CKD和輕度CKD的ROC曲線下總面積(AUC)分別為0.95和0.90。與以MCFAs(己酸居首，癸酸次之)為特征的中度CKD分類不同，早期和晚期CKD分類的高度區(qū)分性標志物是細菌種(Bacteroides eggerthii和Prevotella sp. 885 分別是早期和晚期的特征菌屬)。此外，通過單獨評估那些差異豐富的物種(圖1)和代謝物(圖2)，確定了幾個對特定CKD嚴重組具有臨床有效性的個體標記物(表2)。其中，與尿蛋白/肌酐比(AUC，0.64)或血尿素(AUC，0.72)相比，Bacteroides eggerthii 對診斷早期CKD的AUC(0.80；95%CI，0.67-0.93)更高。我們的結果揭示了有望通過特定腸道微生物早期診斷慢性腎臟病。