編譯：伊安，編輯：小白、江舜堯。

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1. 背景

軟組織（(STSs)）或原發(fā)性骨肉瘤是由多能間充質干細胞惡性轉化而來的罕見腫瘤，肉瘤約占所有腫瘤的1%，而原發(fā)惡性骨腫瘤約占肉瘤的10%。盡管肉瘤的細胞來源相同，但它卻是一組具有不同的病理和遺傳畸變的異質性癌癥，有70種以上不同的組織學亞型。這種生物學上的異質性在臨床上反映為各亞型在自然病程和治療反應方面有所不同。因此，軟組織和骨肉瘤的診斷可以從惰性和可治愈的腫瘤到具有侵襲性、轉移性和復發(fā)臨床表型的高致命性腫瘤。手術整體切除是局部肉瘤治療的主要方法，但若因手術切除在解剖學上不具有可行性，如果腫瘤存在轉移，就必須進行全身化療或放療。雖然尤文肉瘤(ES)和骨肉瘤對化療敏感，但目前大部分患者對化療藥物表現出明顯的耐藥性。此外，有效的新療法受到肉瘤的罕見性和“一刀切”方法的阻礙，同時這種“一刀切”方法導致科研工作者招募具有多種肉瘤亞型的異質性患者進入臨床實驗。盡管最近對某些軟組織肉瘤亞型的靶向療法已經進行了臨床實驗階段，例如治療肺泡軟組織肉瘤的西地尼布，但對于大多數肉瘤亞型的潛在分子驅動因素以及這些因素如何影響治療尚未明確。因此，由于目前對肉瘤生物學特征的理解不足，以及缺乏治療肉瘤的有效方法，需要我們對肉瘤進行進一步深入研究。

自人類基因組計劃完成以來，我們對癌癥相關的遺傳因素有了深入了解。相比之下，人類癌癥的蛋白組研究在很大程度上仍未得到探索，而且蛋白組學研究相對于豐富的基因組研究來說是有限的。這種基因組-蛋白組學的差異在肉瘤研究中表現得尤為明顯，肉瘤蛋白組學研究主要集中在最常見的亞型上，很少有全面的研究。肉瘤蛋白組學研究的缺乏在很大程度上可以歸因于疾病的罕見，疾病樣本的缺乏以及制藥公司對腫瘤藥物的開發(fā)缺乏興趣也會限制其發(fā)展。盡管存在這些限制，蛋白組學探索罕見疾病的潛力不應被低估。用于評估其他類型的癌癥的蛋白組學技術提供了與其基因組對應的互補和對比數據，這有助于推動對疾病的分子機制的理解，例如，識別與癌癥相關的增殖和侵襲等，利用基因組、表觀基因組和蛋白組學時產生比單個數據類型更穩(wěn)定的生物標志物。蛋白組學有利于識別新的生物標志物和治療靶點，這有助于推動對肉瘤分子病理學的研究。蛋白組學研究的目的是通過識別候選生物標志物，來發(fā)現對疾病診斷、患者分層、臨床預后和病程有價值的關鍵蛋白。因此，這些研究允許進行未經證實的疾病監(jiān)測，進而允許進行知情的臨床決定；推動臨床療效的改善。此外，蛋白是絕大多數療法的靶點，因此，識別介導肉瘤進展、轉移和耐藥的關鍵蛋白表達或蛋白修飾，可以為肉瘤的治療提供新的治療途徑。除了直接的臨床效應，考慮到蛋白在調節(jié)生理和病理過程中的作用，蛋白組學能夠為我們提供了重要的生物學見解來改善我們對疾病病因和進展的理解。這種對疾病基本生物學理解的改善最終將為加速這些罕見癌癥的新進展奠定堅實的基礎(圖1)。

在此，我們對肉瘤研究中使用的蛋白組學方法進行了全面的綜述，并確定了蛋白組學在罕見和超罕見肉瘤亞型中的研究現狀，同時對肉瘤蛋白組學的未來進行了展望，強調了該領域目前的局限性，并提出了如何克服這些挑戰(zhàn)來促進研究的迅速發(fā)展。                          

圖1 肉瘤研究中使用蛋白組學方法潛在優(yōu)勢

2. 蛋白組學策略綜述

蛋白組學除了研究蛋白豐度，還對蛋白的調節(jié)和活性進行分析，這有利于推動對單個細胞乃至整個有機體蛋白組學的研究。蛋白組學通過對蛋白異構體、蛋白翻譯后修飾和蛋白-蛋白相互作用進行分析能夠為蛋白的動態(tài)變化提供了詳細的數據。目前質譜（MS）和非MS蛋白組學技術已應用于癌癥研究，這兩種技術有各自的優(yōu)點和缺點（表1）。

肉瘤研究中的非MS蛋白組學方法大部分是基于微陣列，最常見的是反相蛋白微陣列（RPPA）。RPPA需要將腫瘤組織裂解物固定在微陣列表面，然后用抗體靶向蛋白進行探測，這能夠定量評估數百個樣品中的蛋白水平。另外也可以進行抗體陣列研究，這種方法涉及固定一組針對某一系列蛋白靶標的抗體，用已裂解的組織樣品進行探測，這種方法能夠同時評估一個樣品中的多種蛋白。使用抗體陣列研究的優(yōu)勢是只需要極少量的樣本就能進行蛋白組學研究，這正適合研究樣本有限的超罕見肉瘤亞型。雖然非MS蛋白組學已經為對肉瘤研究提供了有價值的新見解，但它們對抗體的依賴性有一定局限。首先，并不是所有的蛋白都有抗體，也不是所有的抗體都是針對目標蛋白，因此想要通過微陣列研究獲取數百個以上的蛋白較為困難。此外，微陣列研究還需要對所研究的蛋白進行明確，因此這種方法不能真實、有效的反映蛋白變化。

在這部分我們將簡要介紹肉瘤研究中已報道的MS蛋白組學。與非MS蛋白組學相比，MS蛋白組學無偏倚，并且能夠進行更敏感和準確的蛋白鑒定，因此，MS衍生的蛋白圖譜更加全面。然而，MS蛋白組學的主要局限性仍然存在，最值得注意的是盡管多重等壓標記技術已經有所進步，但這些方法的通量仍然很低，因此MS分析不太可能得到微陣列所獲得的蛋白通量。

臨床蛋白組學通常涉及對復雜生物樣品的研究，因此在MS分析之前為了提高它的覆蓋率，經常需要在蛋白消化后進行肽段分離。肽段分離的常用方法包括反相液相色譜法、等電聚焦電泳法、強陽離子交換和高pH分餾，這些方法的優(yōu)缺點已在其他地方詳細討論。在二維差異電泳(2D-DIGE)對肉瘤蛋白組學進行研究時，一般是在蛋白消化前用聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）進行蛋白分離，用熒光染料標記2D-DIGE分析的樣品，并使用PAGE進行蛋白分離，掃描帶有染料標記的二維凝膠來顯示樣品之間的差異蛋白點，這些蛋白隨后在“凝膠內”被消化、提取，并由MS鑒定。

樣品分離后，主要使用兩種質譜：電噴霧電離(ESI)或基質輔助激光解吸/電離(MALDI)。無論采用何種方法，都可以通過分析進行蛋白鑒定并解釋產生的蛋白圖譜。為了使用ESI-或MALDI-MS實現蛋白鑒定的高可信度，蛋白組學研究成功的關鍵也需要準確定量。為了實現這一目標已經建立多種方法，但是在肉瘤蛋白組學研究中最常采用的是無標記定量和等壓標記。等壓標記包括相對和絕對定量等壓標記(iTRAQ)和串聯質譜標記(TMT)，在質譜儀中運行不同同位素標簽標記的樣品，片段誘導的標簽裂解后在質譜中生成報告離子，用于對肽和蛋白進行定量。

當前蛋白組學的研究方法能夠對不同的樣本進行分析，這些樣本可以是細胞，也可以是冰凍組織或者福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織。鑒于這些樣本在生物學、化學和物理學方面的差異，某些蛋白組學更適用于對特定樣本類型進行研究。到目前為止，肉瘤的MS蛋白組學研究中使用的絕大多數樣本都是來源于冰凍組織或細胞，這在一定程度上反映了冰凍組織和細胞易提取蛋白。相比之下，由于石蠟和福爾馬林形成的交聯復合物阻礙了蛋白的有效表達，因此從FFPE組織中提取蛋白進行MS蛋白組學分析存在挑戰(zhàn)。目前FFPE組織通常用免疫組織化學(IHC)進行分析，通過提供特定蛋白的空間分辨率來彌補蛋白組學研究的不足。