1. 胰腺癌細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧時(shí)維持生長(zhǎng)和氧化代謝

為了了解胰腺癌細(xì)胞如何適應(yīng)嚴(yán)重的缺氧環(huán)境，作者在病理生理氧張力為0.1%的條件下培養(yǎng)PDAC細(xì)胞系，這與胰腺癌的瘤內(nèi)氧測(cè)量結(jié)果一致。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)所有的PDAC細(xì)胞株在0.1%的氧氣和≥50%的常氧率下都能保持旺盛的生長(zhǎng)（圖1A和S1A）。這與來(lái)源于低缺氧腫瘤類型的細(xì)胞系不同，如肺（A549）和結(jié)腸（HCT116和DLD-1），在嚴(yán)重缺氧（常氧的10%-30%）時(shí)，其增殖明顯減少（圖1A和S1B）。轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-468和MDA-MB-231）在肺/結(jié)腸和PDAC細(xì)胞系之間表現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷（圖1A、S1A和S1B）。然而，所有細(xì)胞系都能在較溫和的缺氧條件下增殖（圖S1A和S1B），這表明PDAC細(xì)胞對(duì)極端缺氧具有獨(dú)特的適應(yīng)能力。盡管肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞都可能在體內(nèi)遭遇腫瘤缺氧，但沒(méi)有一種細(xì)胞顯示出與胰腺癌相同的缺氧水平，因?yàn)檠鯕馐呛铣纱x和增殖的基本代謝需求，我們假設(shè)細(xì)胞在完全缺氧（缺氧）下無(wú)法維持生長(zhǎng)，但可能受到條件限制而存活。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)谌毖鯒l件下培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)使用鈀催化劑消耗氧氣來(lái)維持3.5ppm（<0.001%）的水平。所有細(xì)胞系，無(wú)論腫瘤類型如何，都無(wú)法在缺氧條件下生長(zhǎng)（圖S1A和S1B）；然而，我們發(fā)現(xiàn)所有PDAC細(xì)胞系以及其他一些癌癥細(xì)胞類型（例如，MDA-MB-231、MDAMB-468和DLD-1）能夠在缺氧條件下維持?jǐn)?shù)天的生存能力（圖1B）。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明來(lái)自極度缺氧環(huán)境的細(xì)胞系已經(jīng)進(jìn)化出強(qiáng)大的機(jī)制/代謝途徑來(lái)維持缺氧微環(huán)境中的增殖和生存能力。此外，作者的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了癌細(xì)胞生長(zhǎng)需要消耗氧氣的細(xì)胞過(guò)程。

線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的中心耗氧細(xì)胞器，利用氧氣作為電子受體維持細(xì)胞內(nèi)的生物能量和關(guān)鍵的生物合成反應(yīng)。細(xì)胞呼吸通常被認(rèn)為是細(xì)胞中最重要的耗氧途徑。為了了解嚴(yán)重缺氧時(shí)維持PDAC增殖對(duì)線粒體活性的需求，我們構(gòu)建了線粒體DNA缺陷細(xì)胞（p0），這些細(xì)胞缺乏線粒體基因組中編碼的關(guān)鍵呼吸鏈催化亞基。在正常氧條件下，呼吸功能不全的細(xì)胞與呼吸正常的細(xì)胞相比，其增殖能力下降（圖1C）。我們發(fā)現(xiàn)，在常氧和嚴(yán)重缺氧條件下，p0胰腺癌細(xì)胞的增殖同樣受到線粒體缺失的影響（圖1C）。相反，缺氧條件下非PDAC-p0細(xì)胞在外源性尿苷和丙酮酸存在下似乎獲得增殖優(yōu)勢(shì)（圖1C）。這些數(shù)據(jù)表明線粒體活性對(duì)PDAC的增殖至關(guān)重要，而不依賴于氧的有效性。

圖1 胰腺癌細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧的情況下維持生長(zhǎng)

(A)細(xì)胞暴露在0.1% O2下的相對(duì)增殖率，以常氧生長(zhǎng)的百分比表示(平均值±SEM, n = 3)。增殖率由圖S1所示的三條獨(dú)立生長(zhǎng)曲線的指數(shù)生長(zhǎng)方程計(jì)算。(B)缺氧(0% O2)5天(D5)后活細(xì)胞的百分比(平均值±SEM, n = 3)。(C)線粒體完整或耗盡的細(xì)胞常氧和缺氧(0.1% O2)生長(zhǎng)變化(p0)。p0顯示為完整線粒體的百分比(平均值±SEM, n = 3)。(D)在常氧和低氧(0.1% O2)條件下使用四甲基羅丹明(TMRE)進(jìn)行膜電位測(cè)量。每個(gè)條件記錄10-20個(gè)字段。低氧數(shù)據(jù)以常氧條件的百分比表示。(E)用ETC抑制劑粉蝶霉素A (25 nM)和抗霉素A (50 nM)處理缺氧(0.1% O2)細(xì)胞5天。處理后的細(xì)胞以未處理細(xì)胞的百分比表示(平均值±SEM, n = 3)。(D)和(E)采用Dunnett’s多重比較檢驗(yàn)檢驗(yàn)顯著性，其中n.s.≥0.05，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p ≤ 0.0001。

有研究表明，線粒體呼吸鏈的一個(gè)主要功能是再生用于天冬氨酸生成的電子受體，據(jù)報(bào)道，天冬氨酸既能限制體外缺氧生長(zhǎng)，也能限制體內(nèi)某些實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)。我們的實(shí)驗(yàn)得到了與此一致的結(jié)果，即補(bǔ)充外源性電子受體丙酮酸鹽（提供氧化過(guò)剩細(xì)胞質(zhì)NADH）會(huì)顯著增加癌細(xì)胞在0.1% O2中的生長(zhǎng)（圖S1D）。在這些條件下，添加全身或線粒體靶向抗氧化劑并不能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖(圖S1D)。我們推測(cè)PDAC細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧條件下仍能維持天冬氨酸的生物合成，并進(jìn)行了驗(yàn)證，我們觀察到細(xì)胞暴露于低氧環(huán)境時(shí)，天冬氨酸水平下降了70% - 90%(圖S2A)，這與先前的研究結(jié)果一致，即天冬氨酸限制了低氧生長(zhǎng)。然而，為了評(píng)估天冬氨酸產(chǎn)量的限制是否會(huì)導(dǎo)致天冬氨酸水平的降低，以及更好地了解PDAC細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧狀態(tài)下如何重構(gòu)中心碳代謝，我們采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記示蹤。在常氧條件下，20% - 50%的檸檬酸碳來(lái)自統(tǒng)一標(biāo)記的13C6葡萄糖(圖S2B)，與常氧條件不同，在嚴(yán)重缺氧條件下，所有細(xì)胞系的線粒體葡萄糖利用率都顯著下降(圖S2B)。這伴隨著線粒體丙酮酸氧化的減少(圖S2C)，這與廣泛報(bào)道的通過(guò)典型HIF1介導(dǎo)的丙酮酸脫氫酶激酶1 (PDK1)轉(zhuǎn)錄抑制丙酮酸脫氫酶(PDH)活性的結(jié)果一致。有研究表明，在某些細(xì)胞環(huán)境中，丙酮酸羧化酶(PC)的活性增加是對(duì)PDH失活的一種代償性失活機(jī)制。然而，我們發(fā)現(xiàn)PC活性的增加并不適用于所有的PDAC細(xì)胞系，但在被測(cè)的非PDAC細(xì)胞系中，PC活性的增加是一致的(圖S2D和S2E)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，缺氧的PDAC細(xì)胞經(jīng)歷了典型的葡萄糖代謝重組，并不是主要使用葡萄糖來(lái)合成天冬氨酸來(lái)應(yīng)對(duì)嚴(yán)重的缺氧。對(duì)低氧胰腺癌細(xì)胞的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，HIF1a水平持續(xù)升高，且在下游靶細(xì)胞中富集，證實(shí)PDAC細(xì)胞對(duì)嚴(yán)重缺氧進(jìn)行典型的HIF依賴性適應(yīng)(圖S2F S2H)。

我們實(shí)驗(yàn)室此前報(bào)道PDAC細(xì)胞表現(xiàn)出高谷氨酰胺依賴性。由線粒體天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶2 (GOT2)產(chǎn)生的線粒體谷氨酰胺衍生的天門冬氨酸與細(xì)胞內(nèi)蘋果酸交換生成草酰乙酸，細(xì)胞內(nèi)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT1)通過(guò)轉(zhuǎn)換成蘋果酸和丙酮酸生成細(xì)胞內(nèi)NADPH。為了檢查在缺氧條件下谷氨酰胺衍生的碳對(duì)天門冬氨酸池的貢獻(xiàn)，我們下一步使用統(tǒng)一標(biāo)記的13C5 -谷氨酰胺示蹤劑進(jìn)行追蹤。我們發(fā)現(xiàn)，PDAC細(xì)胞通過(guò)線粒體中GOT2的活性維持大部分天冬氨酸的生成(圖2A)，而其他類型的腫瘤通過(guò)缺氧反應(yīng)中GOT1的活性增加細(xì)胞中天冬氨酸的生成(圖2B和2C)。與此相反，在任何細(xì)胞系中，在嚴(yán)重缺氧環(huán)境下，GOT1和GOT2的表達(dá)都沒(méi)有持續(xù)變化(圖S2I和S2J)，盡管在0.1% O2下，GOT1的表達(dá)有上升的趨勢(shì)。使用RNA干擾去除GOT2(圖S2K)可顯著降低PDAC細(xì)胞系的天冬氨酸水平(圖S2L)和低氧生長(zhǎng)(圖S2M)，這與天冬氨酸生成的作用一致。此外，缺氧時(shí)GOT2的活性與缺氧生長(zhǎng)速率呈正相關(guān)(圖2D)。這些觀察結(jié)果表明，胰腺癌細(xì)胞維持谷氨酰胺缺氧性病變，以維持氧化的谷氨酰胺代謝。此外，氧化性谷氨酰胺代謝的維持是嚴(yán)重缺氧PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵決定因素。

為了評(píng)估胰腺癌細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧時(shí)是否能夠維持足夠的線粒體天冬氨酸的產(chǎn)生，我們進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)通量分析（KFP）測(cè)量從13C5谷氨酰胺到下游代謝物的同位素標(biāo)記動(dòng)力學(xué)，所得的動(dòng)力學(xué)標(biāo)記數(shù)據(jù)結(jié)合絕對(duì)代謝物水平被用來(lái)量化暴露于0.1%氧張力的細(xì)胞中的合成通量。我們發(fā)現(xiàn)PDAC細(xì)胞維持天冬氨酸生產(chǎn)通量（圖2E和2F），其中大多數(shù)天冬氨酸來(lái)自谷氨酰胺（圖S2N）。代謝物水平的變化并不一定與流量的變化有關(guān)，我們的數(shù)據(jù)表明，盡管在缺氧條件下，天冬氨酸水平急劇下降，但生產(chǎn)流量是持續(xù)的，這與天冬氨酸對(duì)缺氧PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)的生物合成限制相矛盾。在穩(wěn)定狀態(tài)下，代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的流量等于其消耗的流量。因此，盡管生產(chǎn)流量持續(xù)，但天冬氨酸濃度的顯著下降可能表明天冬氨酸利用率和細(xì)胞需求發(fā)生了變化。由于天冬氨酸為增殖所需的嘧啶生物合成提供燃料，缺氧PDAC細(xì)胞在極端缺氧時(shí)產(chǎn)生天冬氨酸的能力也意味著PDAC細(xì)胞能夠維持核苷酸的合成。我們觀察到，相對(duì)于非PDAC細(xì)胞，PDAC細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下仍能持續(xù)合成核酸酶，這表明天冬氨酸生產(chǎn)下游的代謝途徑仍能持續(xù)活性(圖S2O)。值得注意的是，A549肺癌細(xì)胞系在嚴(yán)重缺氧條件下，13C5谷氨酰胺形成的天冬氨酸動(dòng)態(tài)標(biāo)記模式不穩(wěn)定，這妨礙了對(duì)合成流量的準(zhǔn)確估計(jì)（圖2G）。在引入標(biāo)記培養(yǎng)基后，A549細(xì)胞試圖維持類似于常氧培養(yǎng)條件的氧化天冬氨酸（M+4）標(biāo)記動(dòng)力學(xué)。然而，標(biāo)記模式很快（在1小時(shí)內(nèi)）轉(zhuǎn)變，以建立一個(gè)獨(dú)特的穩(wěn)定狀態(tài)，由此M+4產(chǎn)量顯著減少，接近0%（圖2G）。這些數(shù)據(jù)表明A549細(xì)胞具有顯著的相對(duì)靜態(tài)的耗氧量，能夠迅速地排出維持M+4產(chǎn)生所需的有效氧。

為了了解還原性谷氨酰胺代謝是否能夠補(bǔ)償氧化GOT2依賴性天冬氨酸生物合成的減少，我們量化了摩爾百分比富集（MPE），這是谷氨酰胺碳隨時(shí)間對(duì)天冬氨酸的總貢獻(xiàn)。與8988T細(xì)胞不同，A549細(xì)胞同時(shí)具有M+4標(biāo)記（圖2E）和來(lái)自谷氨酰胺的MPE（圖S2P），A549細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧條件下表現(xiàn)出谷氨酰胺對(duì)天冬氨酸生物合成（圖S2P）的貢獻(xiàn)減少了30%，并且不能被還原性胞質(zhì)天冬氨酸（M+3）生成的增加所補(bǔ)償（圖S2Q），因此我們假設(shè)PDAC細(xì)胞可以通過(guò)有效利用缺氧微環(huán)境中的氧氣來(lái)維持氧化代謝；缺氧條件下PDAC細(xì)胞中13C5谷氨酰胺13C摻入的穩(wěn)態(tài)分析表明，在缺氧的情況下（圖2H），天冬氨酸的氧化產(chǎn)物顯著減少，與0.1% O2條件下非PDAC細(xì)胞中觀察到的情況相似，表明PDAC耗氧效率提高。缺氧時(shí)耗氧效率的提高將延長(zhǎng)腫瘤中的氧利用率，在血管擴(kuò)散受到限制的腫瘤中賦予氧化代謝和增殖能力。

圖2 胰腺癌細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧時(shí)維持氧化代謝

(A)通過(guò)計(jì)算[U]-13C5谷氨酰胺在穩(wěn)態(tài)下M+4:M+3的分?jǐn)?shù)，測(cè)定缺氧（0.1% O2）中24小時(shí)后GOT2的相對(duì)活性(平均值±SEM, n = 3)。(B)通過(guò)計(jì)算[U]- 13C5谷氨酰胺在穩(wěn)態(tài)下M+3:M+4的分?jǐn)?shù)，測(cè)定缺氧（0.1% O2）中24小時(shí)后GOT1的相對(duì)活性(平均值±SEM, n = 3)。(C)顯示下游標(biāo)簽摻入[U]- 13C5谷氨酰胺的示意圖。M+4通過(guò)線粒體天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶2 (GOT2)的氧化活性(淺灰色)產(chǎn)生，M+3通過(guò)細(xì)胞質(zhì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT1)的還原活性產(chǎn)生(深灰色)。(D)低氧(0.1% O2) GOT2活性(M+4:M+3)與低氧(0.1% O2)生長(zhǎng)速率(每小時(shí))的線性回歸。根據(jù)圖S1中的生長(zhǎng)曲線計(jì)算缺氧（0.1% O2）增長(zhǎng)率。(E)用[U]- 13C5谷氨酰胺在正常和嚴(yán)重缺氧（0.1%O2）8988T細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)標(biāo)記數(shù)據(jù)(平均值±SEM, n = 3)。(F)用[U]- 13C5谷氨酰胺計(jì)算正常和嚴(yán)重缺氧（0.1% O2）8988T細(xì)胞的天冬氨酸生產(chǎn)通量（平均值±95%可信區(qū)間[CI]，n=3）。(G)用[U]- 13C5谷氨酰胺在正常和嚴(yán)重缺氧（0.1% O2）A549細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)標(biāo)記數(shù)據(jù)（平均值±SD，n=3）。(H)在缺氧（0% O2）或缺氧（0.1% O2）條件下24小時(shí)后，8988T和A549細(xì)胞中[U]-13C5谷氨酰胺的天冬氨酸（M+4）百分比（平均值±SD，n=3）。缺氧（0.1% O2）8988T和A549的數(shù)值如（E）和（G）所示。(A)和(B)采用Dunnett’s多重比較檢驗(yàn)檢驗(yàn)顯著性，其中***p < 0.001, and ****p ≤ 0.0001。(B)-(E)采用Dunnett’s多重比較檢驗(yàn)檢驗(yàn)顯著性，其中n.s.≥0.05，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p ≤ 0.0001。

2. 線粒體呼吸超復(fù)合體支持胰腺癌嚴(yán)重缺氧期間有效的電子轉(zhuǎn)移

我們的研究結(jié)果表明，在低氧條件下，胰腺癌細(xì)胞的線粒體氧化代謝被保留以允許生長(zhǎng)。我們假設(shè)，為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，PDAC細(xì)胞必須使用機(jī)制來(lái)保存健康的線粒體池，并使有效利用低濃度的氧氣可用。透射電鏡(TEM)分析顯示，8988T細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧狀態(tài)下仍能維持線粒體數(shù)量(圖3A和3B)和形態(tài)(圖3)。然而，A549細(xì)胞在缺氧條件下無(wú)法增殖或維持細(xì)胞活力，線粒體數(shù)量、嵴密度和形態(tài)顯著下降，表明線粒體適合度下降(圖3)。維持健康的線粒體池需要生物發(fā)生、裂變、融合和降解的動(dòng)態(tài)平衡。這些過(guò)程的差異可能會(huì)損害細(xì)胞活力，表明線粒體動(dòng)態(tài)在嚴(yán)重缺氧的胰腺癌細(xì)胞中保持完整，并可能是觀察到的生長(zhǎng)和氧化線粒體活性的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。

呼吸鏈復(fù)合物在線粒體內(nèi)膜褶皺內(nèi)組裝成稱為超復(fù)合物的四級(jí)結(jié)構(gòu)，線粒體嵴形狀決定呼吸鏈超復(fù)合物的組裝和呼吸效率。由于在缺氧胰腺癌細(xì)胞中線粒體和嵴的形態(tài)沒(méi)有改變，我們推測(cè)線粒體超復(fù)合物的存在可能有助于提高ETC效率。通過(guò)藍(lán)綠溫和膠（BN-PAGE）對(duì)超復(fù)合物形成的對(duì)比分析證實(shí)，缺氧PDAC細(xì)胞中存在呼吸超復(fù)合物，其中呼吸超復(fù)合物的豐度和組成似乎并未受到氧張力的實(shí)質(zhì)性影響（圖S3A和S3B）。然而，在缺氧A549細(xì)胞中觀察到高分子量超復(fù)合物的豐度顯著降低（圖S3A和S3B）。線粒體呼吸超復(fù)合物穩(wěn)定的關(guān)鍵決定因素是特定的組裝因子，如SCAF1（SCAF1是COX7A2（COX7A2L）的長(zhǎng)亞型），是穩(wěn)定含有超絡(luò)合物的絡(luò)合物III和絡(luò)合物IV所需的真正的超絡(luò)合物組裝因子。由于HIF已被報(bào)道通過(guò)更有效的電子轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C氧化酶（COX）亞型的表達(dá)以優(yōu)化低氧下的呼吸效率，我們?cè)u(píng)估了嚴(yán)重缺氧時(shí)COX7A2L的表達(dá)。與這些報(bào)告一致，我們檢測(cè)到COX4-2的mRNA表達(dá)增加（圖S3C），同時(shí)COX4-1（圖S3D）在暴露于0.1% O2的所有細(xì)胞系中同時(shí)降低。與PDAC細(xì)胞不同，在肺癌細(xì)胞中觀察到COX7A2L的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均降低（圖S3E和S3F），這與在極低氧條件下觀察到的線粒體數(shù)量減少一致?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明PDAC細(xì)胞系在嚴(yán)重缺氧時(shí)維持線粒體數(shù)量和形態(tài)，維持呼吸活動(dòng)和線粒體超復(fù)合物的組裝。

圖3 胰腺癌細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧時(shí)維持線粒體形態(tài)

（A）正常氧（左）或嚴(yán)重缺氧（0.1% O2）（右）24小時(shí)后8988T（上）和A549（下）細(xì)胞系的典型TEM圖像。（B）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）條件下8988T和A549細(xì)胞的線粒體數(shù)量。利用單盲法（平均值±SEM，n=6），在34003倍放大率下，每個(gè)條件收集了至少6張圖像。（C）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）8988T和A549細(xì)胞線粒體嵴數(shù)的定量分析。用單盲法收集的圖像中隨機(jī)計(jì)算每個(gè)條件下21到39個(gè)線粒體的最大嵴寬度（平均值±SEM，n>20）。（D）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）下8988T和A549細(xì)胞平均嵴長(zhǎng)度的定量分析。平均嵴長(zhǎng)度是從每個(gè)條件下隨機(jī)收集的2139個(gè)線粒體從用戶盲法收集的圖像（平均值±SEM，n>20）計(jì)算。（E）正常氧或重度缺氧（0.1% O2）下8988T和A549細(xì)胞最大嵴寬度的定量分析。從每個(gè)條件下隨機(jī)采集的2139個(gè)線粒體，用單盲法收集的圖像計(jì)算最大嵴寬度（平均值±SEM，n>20）。

我們假設(shè)通過(guò)COX7A2L的基因靶向破壞超復(fù)合物的組裝可能會(huì)通過(guò)降低ETC的效率而使PDAC細(xì)胞系對(duì)低氧環(huán)境敏感。使用兩個(gè)獨(dú)立的發(fā)夾對(duì)抗COX7A2L（圖4A和S4A），我們發(fā)現(xiàn)復(fù)合I連接和復(fù)合IV連接呼吸減少（圖S4B），但對(duì)基礎(chǔ)呼吸無(wú)顯著影響（圖S4C）。與此同時(shí)，還觀察到含有復(fù)合物III和復(fù)合物IV的超配合物的減少(圖S4D)，表明兩種發(fā)夾均有靶向效應(yīng)。透射電鏡分析顯示，在失去COX7A2L后，嵴長(zhǎng)度顯著減少（圖S4E）和最大嵴寬度增加（圖S4F），這對(duì)線粒體數(shù)量（圖S4G）或每個(gè)線粒體的嵴數(shù)量（圖S4H）沒(méi)有顯著影響，與氧張力無(wú)關(guān)。重要的是，COX7A2L的缺失并不影響內(nèi)源性ETC復(fù)合物I、III和IV的表達(dá)（圖4A），這意味著通過(guò)COX7A2L的基因靶向而喪失超復(fù)合物組裝提供了一種將超復(fù)雜物活性與單個(gè)ETC復(fù)合物活性分離的機(jī)制。

為了評(píng)估失去超復(fù)合物形成的功能影響，我們描述了COX7A2L缺陷PDAC細(xì)胞的代謝特征。COX7A2L的喪失顯著降低了ATP水平（圖4B），在嚴(yán)重缺氧中觀察到更為嚴(yán)重的下降，這表明呼吸超復(fù)合物的耗竭選擇性地影響這些氧張力下的線粒體效率。接下來(lái)，我們推斷氧化還原平衡（氧化還原反應(yīng)）也會(huì)因COX7A2L的丟失而受到干擾。缺氧通過(guò)減緩電子傳遞和降低NADH氧化速率來(lái)降低線粒體NAD+/NADH比率。除了在缺氧時(shí)觀察到的NAD+/NADH降低外，COX7A2L的損失在NAD+/NADH比率中降低，特別是在低氧條件下（圖4C）。因此，我們推測(cè)COX7A2L缺陷細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體效率降低，這將限制PDAC細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧條件下的增殖能力。我們發(fā)現(xiàn)COX7A2L缺陷細(xì)胞在0.1% O2中表現(xiàn)出明顯的膜電位（圖4D）和天冬氨酸生產(chǎn)通量（圖4E）的降低。此外，我們觀察到COX7A2L缺陷PDAC細(xì)胞的增殖能力顯著降低，特別是在低氧環(huán)境中（圖4F），通過(guò)添加丙酮酸鹽（圖4G）而不是Mito-TEMPO（圖4G）可以持續(xù)挽救這種細(xì)胞的增殖能力。為了探討外源性COX7A2L的表達(dá)是否能夠挽救缺氧性生長(zhǎng)，我們?cè)?902細(xì)胞系（圖S4I）中過(guò)度表達(dá)COX7A2L，與其他PDAC細(xì)胞系相比，其內(nèi)源性COX7A2L水平較低（圖S3D）。適度過(guò)度表達(dá)COX7A2L可增加基礎(chǔ)呼吸、復(fù)合物III連接呼吸和復(fù)合物IV連接呼吸（圖S4J和S4K），導(dǎo)致增殖能力增加，與氧張力無(wú)關(guān)（圖4L）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明線粒體超復(fù)合物的維持對(duì)于嚴(yán)重缺氧的生長(zhǎng)非常重要，因?yàn)樗鼮橐认侔┘?xì)胞提供了代謝優(yōu)勢(shì)（圖4H）。

圖4 在嚴(yán)重缺氧的胰腺癌細(xì)胞中，線粒體呼吸超復(fù)合體是代謝適應(yīng)所必需的

（A）具有代表性的蛋白質(zhì)印跡顯示在8988T細(xì)胞中COX7A2L被敲除，內(nèi)源性復(fù)合物I（NDUFB8）、復(fù)合物III（UQCR2）和復(fù)合物IV（MTCO1）的表達(dá)不變。ERK2用作加載控制。（B）重度缺氧（0.1% O2）24小時(shí)后8988T細(xì)胞（左）和MIAPaCa-2細(xì)胞（右）細(xì)胞ATP水平下降百分比，并伴有COX7A2L丟失。ATP水平標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白質(zhì)含量。數(shù)據(jù)以shGFP（綠色熒光蛋白）的百分比表示（平均值±SEM，n=3）。（C）嚴(yán)重缺氧（0.1% O2）8h后，8988T細(xì)胞（左）和MIAPaCa-2細(xì)胞（右）中NAD+/NADH的比值（平均值±SD，n=3）。（D）正常氧和重度缺氧（0.1% O2）條件下COX7A2L敲除8988T細(xì)胞的相對(duì)TMRE熒光。TMRE值標(biāo)準(zhǔn)化為線粒體大小和FCCP處理。每個(gè)條件記錄12-22個(gè)字段。（E）用[U]-13C5谷氨酰胺（平均值±95%可信區(qū)間[CI]，n=3）量化在常氧和嚴(yán)重缺氧（0.1% O2）條件下COX7A2L缺失的8988T細(xì)胞的天冬氨酸生產(chǎn)通量。（F）在常氧或嚴(yán)重缺氧（0.1% O2）條件下5天后，通過(guò)COX7A2L敲除的8988T、MIAPaCa-2、PANC-1、HPAC和8902細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞數(shù)（數(shù)據(jù)與shGFP對(duì)照組相關(guān)），（平均值±SEM，n=3）。（G）在嚴(yán)重缺氧（0.1% O2）下，用外源性丙酮酸（0.25 mM）或米托替波（20 mM）處理5天后，8988T細(xì)胞（左）和MIAPaCa-2細(xì)胞（右）生長(zhǎng)變化的百分比。所示數(shù)據(jù)與shGFP相關(guān)（平均值±SEM，n>3）。（H）圖解說(shuō)明缺氧胰腺癌細(xì)胞失去超復(fù)合物的代謝后果。完整的超復(fù)合物（左）和丟失的超復(fù)合物（右）是使用呼吸體（復(fù)合物I，III2和IV）來(lái)證明的。在（B）–（G）中使用Dunnett的多重比較試驗(yàn)確定顯著性，其中n.s.≥0.05，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

3. 有效的電子轉(zhuǎn)移通過(guò)減少氧化應(yīng)激和提高代謝效率對(duì)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)非常重要

由于氧張力的降低增加了胰腺癌細(xì)胞線粒體呼吸超復(fù)合物的功能相關(guān)性，我們假設(shè)擾動(dòng)超復(fù)合物的形成會(huì)影響腫瘤的生長(zhǎng)。為了驗(yàn)證皮下腫瘤模型中是否存在腫瘤缺氧，我們進(jìn)行了光聲成像以區(qū)分氧和脫氧血紅蛋白的區(qū)域（圖S4M）。皮下腫瘤顯示出相似的氧合模式，其中組織氧合在增生邊緣周圍較高，而向腫瘤核心持續(xù)降低（圖S4M）。為了確定失去超復(fù)合物是否能減少腫瘤生長(zhǎng)，我們將COX7A2L基因敲除的胰腺癌細(xì)胞皮下植入，并評(píng)估腫瘤進(jìn)展情況。胰腺癌細(xì)胞中COX7A2L的缺失導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和負(fù)荷顯著降低（圖5A 5D），其中在發(fā)夾處觀察到更顯著的影響，從而導(dǎo)致更強(qiáng)的COX7A2L敲除（圖S4N）；相反，COX7A2L的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)（圖S4O和S4P）。這些結(jié)果表明，通過(guò)超復(fù)合物組裝進(jìn)行有效的電子轉(zhuǎn)移對(duì)于體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)是非常重要的。為了證實(shí)超復(fù)合物在維持體內(nèi)ETC效率中的作用，我們利用脂質(zhì)過(guò)氧化的標(biāo)志物丙二醛（MDA）評(píng)估了由ETC損傷引起的活性氧物種（ROS）的生成。與對(duì)照組相比，缺乏COX7A2L的皮下腫瘤的MDA染色呈上升趨勢(shì)(圖S4Q)。此外，裂解的caspase-3的染色也有所增加(圖S4R)。然而，Ki67的染色沒(méi)有顯著差異（圖S4S）。這些結(jié)果表明，由于ETC效率受損，失去超復(fù)合物會(huì)增加ROS介導(dǎo)的損傷和細(xì)胞死亡。

除了在所有真核生物中發(fā)現(xiàn)的COX依賴性呼吸途徑外，植物和低等生物通過(guò)交替氧化酶（AOX）進(jìn)行另一種呼吸途徑。AOX能使電子從泛醌轉(zhuǎn)移到氧而不影響質(zhì)子梯度，從而繞過(guò)內(nèi)源性復(fù)合物III和IV的活性：因?yàn)锳OX的存在不影響NADH連接的氧化磷酸化，所以膜電位/完整性和超絡(luò)合物組裝都不會(huì)受到影響。在內(nèi)源性ETC絡(luò)合物存在下，AOX競(jìng)爭(zhēng)電子。然而，與絡(luò)合物III相比，AOX對(duì)泛醌的親和力較低（0.53 0.38 mM，而<20 mM）；因此，當(dāng)復(fù)合物III和下游細(xì)胞色素途徑功能完整時(shí)，AOX不接受電子。只有當(dāng)泛醌被過(guò)度還原時(shí)，例如當(dāng)復(fù)合物III或IV功能失調(diào)時(shí)，AOX才會(huì)將電子從泛醌轉(zhuǎn)移到氧。

為了確定繞過(guò)ETC的復(fù)合物III和IV是否能減輕缺氧胰腺癌細(xì)胞在超復(fù)合物組裝破壞時(shí)所觀察到的生長(zhǎng)缺陷，我們?cè)赑DAC細(xì)胞中異位表達(dá)玻璃海鞘中的AOX，并用復(fù)合物III抑制劑抗霉素A處理細(xì)胞以確保AOX的功能性。表達(dá)AOX的胰腺癌細(xì)胞能夠在抗霉素A存在下恢復(fù)耗氧量（圖S5A）、生長(zhǎng)（圖S5B）和天冬氨酸豐度（圖S5C），這意味著AOX在內(nèi)源性復(fù)合物III的存在下具有適當(dāng)?shù)墓δ堋Ｒ驗(yàn)锳OX對(duì)氧的親和力比COX低（1 2 mM比0.1 0.15 mM），我們的體外研究將氧的功能性從0.0%增加到1%。在暴露于1%氧氣的細(xì)胞中，AOX的表達(dá)恢復(fù)了天冬氨酸水平（圖S5D和S5E），并顯著挽救了COX7A2L缺陷細(xì)胞的缺氧生長(zhǎng)（圖5E）。重要的是，在COX7A2L野生型細(xì)胞中沒(méi)有觀察到差異，這表明在完整超配合物存在的情況下，AOX不參與電子轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明，AOX的存在可以繞過(guò)在體外缺氧應(yīng)激條件下與超復(fù)合物形成丟失有關(guān)的代謝和生長(zhǎng)缺陷。

為了確定AOX的表達(dá)是否能在COX7A2L被敲除時(shí)挽救體內(nèi)生長(zhǎng)，我們將COX7A2L缺失的對(duì)照或AOX表達(dá)細(xì)胞皮下植入以評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)；我們發(fā)現(xiàn)AOX的表達(dá)在腫瘤進(jìn)展和體重方面彌補(bǔ)了COX7A2L敲除的體內(nèi)生長(zhǎng)缺陷（圖5F和5G）。接下來(lái)，我們?cè)u(píng)估了腫瘤內(nèi)的天冬氨酸水平，發(fā)現(xiàn)COX7A2L的缺失降低了腫瘤內(nèi)的天冬氨酸，這與體外數(shù)據(jù)一致，AOX的加入完全挽救了這一點(diǎn)（圖5H）。此外，在具有完整的超復(fù)合物組裝的情況下，對(duì)照組和表達(dá)AOX的腫瘤在生長(zhǎng)或大小上沒(méi)有差異，這表明AOX只有在破壞超復(fù)合物形成時(shí)才具有功能活性?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，失去超復(fù)合物組裝會(huì)影響體內(nèi)ETC的效率/功能性，使AOX活性得以挽救與COX7A2L損失相關(guān)的生長(zhǎng)和代謝缺陷（圖5I）。

圖5 通過(guò)超復(fù)合物組裝的呼吸效率對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)很重要

（A）在皮下植入2×106個(gè)8988T細(xì)胞并丟失COX7A2L后，記錄測(cè)定腫瘤體積的測(cè)量值，以評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況（平均值 SEM，每組n≥8，第93天p=0.015）。（B）在終點(diǎn)測(cè)量腫瘤重量（平均值 SEM，每組n≥8，第93天p=0.021）。（C）在2×106個(gè)缺失COX7A2L的MIAPaCa-2細(xì)胞皮下植入后，記錄測(cè)定腫瘤體積的測(cè)量結(jié)果，以評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況（平均值 SEM，每組n≥7，第24天p=0.0059）。（D）在終點(diǎn)測(cè)量腫瘤重量（平均值 SEM，每組n≥7，24天p=0.0302）。（E）表達(dá)空載體（EV）或AOX的MIAPaCa-2細(xì)胞在1%氧氣條件下增殖5天后的相對(duì)細(xì)胞數(shù)（平均值 SEM，每組n=5，p=0.0223）。（F）在2×106個(gè)表達(dá)EV或AOX的MIAPaCa-2細(xì)胞在COX7A2L缺失的情況下被植入皮下后，記錄確定腫瘤體積的測(cè)量結(jié)果，以評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況（平均掃描電鏡，每組nr9，第18天p=0.0271）。（G）在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)測(cè)量腫瘤重量（平均值 SEM，每組n≥14，p=0.0147）。（H）用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）從第12天采集的5mg組織中定量分析腫瘤天冬氨酸水平（平均值 SEM，n=5，p=0.0116）。（I）示意圖顯示AOX表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞如何拯救與缺氧胰腺癌細(xì)胞超復(fù)合物形成丟失相關(guān)的代謝和增殖缺陷。在（A）–（G）中使用Dunnett的多重比較試驗(yàn)確定顯著性，其中n.s.≥0.05，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

胰腺癌嚴(yán)重缺氧的程度被預(yù)測(cè)對(duì)這些腫瘤的生物學(xué)意義重大。我們的數(shù)據(jù)表明胰腺癌細(xì)胞在極度缺氧的環(huán)境（0.1%的氧氣）中保持著旺盛的增殖，在這種極端缺氧環(huán)境中生長(zhǎng)的能力矛盾地依賴于氧化代謝和線粒體呼吸的活動(dòng)和維持。

缺氧是一種生理狀態(tài)，它可以作用于主要器官和組織，導(dǎo)致氧張力低于空氣飽和組織氧合在3%到7%之間，但可以低至0.5%，例如，在大范圍內(nèi)。對(duì)于ETC活性，氧氣水平在0.3%時(shí)成為速率限制；然而，COX對(duì)氧氣具有非常高的親和力，表觀KM值接近0.1% O2。我們發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞在缺氧水平下有效率，這種現(xiàn)象在其他低缺氧的腫瘤類型中并不普遍，對(duì)高效呼吸的要求決定了胰腺癌的缺氧生長(zhǎng)。

我們的研究表明，通過(guò)COX7A2L基因靶向形成線粒體超復(fù)合物有助于提高呼吸效率；然而，這并不排除其他環(huán)境中其他組裝因子的擾動(dòng)也可能導(dǎo)致線粒體柔軟度降低的可能性。線粒體超復(fù)合物的形成在正常氧的胰腺癌細(xì)胞中是多余的，這表明在有限的氧氣條件下，有效的電子轉(zhuǎn)移變得越來(lái)越重要。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，線粒體超復(fù)合物最近被描述為增加胸廓子宮內(nèi)膜癌的耐缺氧能力。此外，我們顯示這些腫瘤類型在缺氧條件下保持顯著的生存能力，說(shuō)明了胰腺癌缺氧的嚴(yán)重性，并強(qiáng)調(diào)了腫瘤根治術(shù)具有挑戰(zhàn)性的另一個(gè)原因。我們的數(shù)據(jù)表明，生長(zhǎng)需要氧氣，但不一定要維持生存能力，這可能對(duì)腫瘤生物學(xué)有重要意義。

沒(méi)有完整或有功能的線粒體，細(xì)胞將被迫依賴外源性營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，例如如修復(fù)和增殖，從而進(jìn)行細(xì)胞過(guò)程。胰腺癌的特點(diǎn)是基底水平高的自噬和大胞飲增多，這被認(rèn)為在缺氧時(shí)增加，提供細(xì)胞代謝物。我們的結(jié)果表明，獨(dú)立于此，胰腺腫瘤細(xì)胞有獨(dú)特的能力維持氧化線粒體代謝，持續(xù)合成代謝和在缺氧下生長(zhǎng)。此外，這種表型可能與Kirsten大鼠肉瘤（KRAS）狀態(tài)無(wú)關(guān)，因?yàn)檠芯恐惺褂玫拇蠖鄶?shù)PDAC細(xì)胞系都是KRAS突變株，MDA-MB-468除外。據(jù)報(bào)道，天冬氨酸可抑制體內(nèi)某些類型腫瘤的生長(zhǎng)，但在胰腺癌中未發(fā)現(xiàn)這種情況。通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體氧化還原以允許卵泡和維持天門冬氨酸的合成，胰腺癌中的線粒體效率可能為這種情況提供一種解釋。據(jù)報(bào)道，HIF1通過(guò)抑制GOT1和GOT2活性和表達(dá)直接抑制天冬氨酸生物合成；雖然我們觀察到所有受測(cè)細(xì)胞系的HIF1穩(wěn)定，但我們沒(méi)有觀察到GOT1或GOT2表達(dá)的普遍抑制（圖S2J）。

線粒體功能障礙的細(xì)胞和缺氧細(xì)胞中，還原性羧化作用的增加已經(jīng)得到了很好的描述。據(jù)推測(cè)，線粒體NAD+/NADH降低時(shí)，還原性羧化作用增加，以轉(zhuǎn)移氧化TCA循環(huán)代謝中的碳，增加新生脂肪生成，并通過(guò)蘋果酸脫氫酶再生NADH，以維持糖酵解。因?yàn)槲覀兊臄?shù)據(jù)表明，胰腺癌細(xì)胞在缺氧時(shí)誘導(dǎo)還原性羧化的程度與其他細(xì)胞類型不同，這可能表明它們更有效地維持NAD（H）內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

我們的研究結(jié)果表明，PDAC中的呼吸超復(fù)合物對(duì)嚴(yán)重缺氧條件下的代謝效率是必要的。細(xì)胞株在嚴(yán)重缺氧時(shí)不能維持增殖或在缺氧中存活，線粒體數(shù)量和形態(tài)都會(huì)發(fā)生生理性的下降，這可能會(huì)對(duì)呼吸功能產(chǎn)生負(fù)面影響。據(jù)報(bào)道，缺氧可誘導(dǎo)線粒體分裂以促進(jìn)有絲分裂，通過(guò)自噬有效地消除受損的線粒體，從而限制ROS的生成。進(jìn)一步說(shuō)來(lái)，這可能表明胰腺癌細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出強(qiáng)大的細(xì)胞機(jī)制來(lái)減少線粒體ROS和/或損傷。盡管我們的數(shù)據(jù)有力地支持PDAC細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧下保持完整的ETC功能，但通過(guò)TMRE熒光強(qiáng)度測(cè)量線粒體膜電位可能會(huì)因線粒體形態(tài)、位置或質(zhì)量的差異而混淆。此外，在能量學(xué)受損的情況下，通過(guò)逆轉(zhuǎn)不健康線粒體中的ATP合成酶可以維持膜電位。

總的來(lái)說(shuō)，我們的研究表明，無(wú)論在體外還是在體內(nèi)，線粒體呼吸超復(fù)合體都是胰腺癌細(xì)胞在嚴(yán)重缺氧狀態(tài)下生長(zhǎng)的重要組成部分。通過(guò)靶向促進(jìn)其組裝或維持其穩(wěn)定性的關(guān)鍵蛋白來(lái)擾亂超復(fù)合體的形成，可能對(duì)這種致命疾病有治療應(yīng)用。