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編譯：不二，編輯：十九、江舜堯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 導(dǎo)讀原腸胚三個(gè)初始胚層的形成是建立脊椎動(dòng)物身體發(fā)育必不可少的步驟，并且與主要的轉(zhuǎn)錄變化相關(guān)。這些變化伴隨著表觀遺傳重編程，但是表觀基因組在調(diào)節(jié)早期細(xì)胞命運(yùn)的作用仍未得到解決，并且不同胚層之間的分子相互作用尚不清楚。本研究描繪了在小鼠原腸胚發(fā)生過(guò)程中染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和RNA表達(dá)的單細(xì)胞多組學(xué)圖譜。多能性的起始與整體抑制性的表觀遺傳的建立一致，隨后在原腸胚發(fā)生中出現(xiàn)了細(xì)胞譜系特異性的表觀遺傳模式。值得注意的是，位于中胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞在增強(qiáng)子標(biāo)記處經(jīng)歷了廣泛的協(xié)同表觀遺傳重排，這是由TET（ten-eleven translocation）介導(dǎo)的去甲基化和可及性增加。相比之下，外胚層細(xì)胞的甲基化和可及性已在早期表皮細(xì)胞中建立。因此，在決定細(xì)胞命運(yùn)之前，每個(gè)胚層相關(guān)的調(diào)控元件在表觀遺傳上活化或重塑，從而為初始胚層的分層出現(xiàn)提供了分子框架。原名：Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution 譯名：在單細(xì)胞分辨率下對(duì)小鼠原腸胚的多組學(xué)分析 期刊：Nature IF：43.07 發(fā)表時(shí)間：2019.12 通訊作者：Oliver Stegle，John C. Marioni 和 Wolf Reik 通訊作者單位：歐洲生物信息學(xué)研究所（EMBL-EBI）和英國(guó)巴布拉漢研究所 DOI號(hào)：10.1038/s41586-019-1825-8 小鼠胚胎樣本：本研究使用的是C57BL/6Babr品系小鼠，母鼠懷孕E4.5-E7.5時(shí)收集胚胎，每個(gè)胚層至少獲得50個(gè)細(xì)胞。 Tet TKO細(xì)胞培養(yǎng)：Tet1?/?、Tet2?/?、Tet3?/?及野生型ES細(xì)胞的胚體分別在分化后第2、4、5、6和7天收集。 測(cè)序數(shù)據(jù)：樣本制成單細(xì)胞懸液，分配到96孔PCR板中，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，使用NextSeq500平臺(tái)分別進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序（scRNA-seq）和單細(xì)胞核小體甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scNMT-seq）。ChIP-seq數(shù)據(jù)下載與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE125318.）。 生物信息學(xué)分析：測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控和過(guò)濾后，比對(duì)到小鼠參考基因組（GRCm38）上。進(jìn)行基因注釋和定量，以及甲基化和可及性定量。對(duì)RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞譜系鑒定，對(duì)RNA表達(dá)和啟動(dòng)子表觀遺傳狀態(tài)進(jìn)行相關(guān)性分析，對(duì)DNA甲基化和染色質(zhì)可及性進(jìn)行差異分析。對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)因子分析（MOFA）。 多能性起始的表觀基因組動(dòng)態(tài) 研究了每個(gè)過(guò)渡階段中DNA甲基化和染色質(zhì)可及性的變化。在胚胎組織中整體甲基化水平從約25％增加到約75％，在胚外組織中增加到約50％，這主要是由從E4.5到E5.5的de novo甲基化所引起的，并優(yōu)先針對(duì)CpG-poor的基因組位點(diǎn)（圖1e）。相比之下，我們觀察到整體染色質(zhì)可及性從E4.5的約38％逐漸下降到E7.5的約30％（圖1f），胚胎組織和胚外組織之間沒(méi)有差異。為了將每個(gè)階段的表觀遺傳學(xué)變化與轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)聯(lián)系起來(lái)，我們對(duì)每個(gè)基因和每個(gè)胚胎細(xì)胞進(jìn)行了RNA表達(dá)與啟動(dòng)子上相應(yīng)的DNA甲基化或染色質(zhì)可及性之間的相關(guān)性研究。在測(cè)試的5000個(gè)基因中，我們鑒定了125個(gè)基因的表達(dá)與啟動(dòng)子DNA甲基化顯著相關(guān)，而52個(gè)基因的表達(dá)與染色質(zhì)可及性顯著相關(guān)（圖1g）。這些基因座位主要由早期多能性和胚層細(xì)胞的標(biāo)記基因組成，例如Dppa4、Zfp42、Tex19.1和Pou3f1（圖1g，h），這些標(biāo)記基因受到抑制，與整體甲基化的增加和可及性的減少相吻合。此外，該分析還鑒定了可能在發(fā)育中發(fā)揮未知作用的基因，包括Trap1a和Zfp981。值得注意的是，在E4.5之后被上調(diào)的基因中，只有39個(gè)和9個(gè)基因分別顯示出RNA表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化或可及性之間的顯著相關(guān)性。這表明這些基因的上調(diào)可能受其他調(diào)節(jié)元件控制。
圖1 小鼠原腸胚的單細(xì)胞多組學(xué)分析。
為了了解胚層中所有三個(gè)分子層之間的關(guān)系，研究者接下來(lái)將多組學(xué)因子分析（MOFA）應(yīng)用于E7.5的細(xì)胞。MOFA跨多個(gè)數(shù)據(jù)模式同時(shí)執(zhí)行無(wú)監(jiān)督的降維，從而通過(guò)少量的推斷因素來(lái)捕獲細(xì)胞間變異性的整體來(lái)源。值得注意的是，該模型利用了來(lái)自相同細(xì)胞的多元測(cè)量，檢測(cè)了不同數(shù)據(jù)模式之間的協(xié)同變化。使用蛋白編碼基因的RNA測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)以及預(yù)測(cè)的調(diào)控元件的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)，作為模型的輸入數(shù)據(jù)。這包括對(duì)遠(yuǎn)端H3K27ac（增強(qiáng)子）和H3K4me3（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）的啟動(dòng)子和胚層特異性染色質(zhì)免疫沉淀的DNA測(cè)序（ChIP-seq）。MOFA鑒定了六個(gè)因子，前兩個(gè)因子捕獲了三個(gè)胚層的出現(xiàn)（圖2a，b）。值得注意的是，MOFA將基因表達(dá)水平的變異與細(xì)胞譜系特異性增強(qiáng)子標(biāo)記的甲基化和可及性變化聯(lián)系起來(lái)（圖2c）。相比之下，在啟動(dòng)子或H3K4me3標(biāo)記區(qū)域的表觀遺傳變化與胚層形成顯示出非常弱的相關(guān)性（圖2a）。這支持了其他研究將遠(yuǎn)端增強(qiáng)子作為細(xì)胞譜系驅(qū)動(dòng)的調(diào)控區(qū)域?；蚺c增強(qiáng)子相關(guān)性分析鑒定了關(guān)鍵胚層標(biāo)記基因相關(guān)的增強(qiáng)子，這些標(biāo)記基因包括Lefty2和Mesp2（中胚層）、Foxa2和Bmp2（內(nèi)胚層）以及Bcl11a和Sp8（外胚層）（圖2c）。值得注意的是，外胚層特異性增強(qiáng)子比中胚層和內(nèi)胚層特異性增強(qiáng)子顯示出更少的相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)將在下面進(jìn)一步探討。其余四個(gè)因子對(duì)應(yīng)于與前后軸模式（因子3）、脊索形成（因子4）、中胚層模式（因子5）和細(xì)胞周期（因子6）相關(guān)的其他轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)特征。最后，鑒定了可介導(dǎo)或響應(yīng)胚層表觀遺傳變化的轉(zhuǎn)錄因子。將差異表達(dá)信息與在不同可及性基因座位的motif富集整合在一起后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞譜系特異性增強(qiáng)子富集了與關(guān)鍵發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)，包括外胚層的POU3F1、SOX2和SP8，內(nèi)胚層的SOX17、HNF1B和FOXA2，以及中胚層的GATA4、HAND1和TWIST1（圖2d）。
圖2 MOFA分析揭示了胚層中增強(qiáng)子協(xié)同的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組變異。
增強(qiáng)子表觀基因組的時(shí)間分辨率接下來(lái)，研究了與特異胚層相關(guān)的表觀基因組模式在發(fā)育過(guò)程中的產(chǎn)生過(guò)程。內(nèi)胚層和中胚層中的增強(qiáng)子DNA甲基化水平與全基因組動(dòng)態(tài)一致，在所有細(xì)胞類型中從平均25％增至80％（圖3）。在細(xì)胞譜系特異性方面，它們以細(xì)胞類型特異性方式協(xié)同去甲基化至約50％。染色質(zhì)可及性觀察到相反的模式，中胚層和內(nèi)胚層中的增強(qiáng)子可及性最初從大約40％降低到30％，而細(xì)胞譜系特異性的可及性升至約45％。因此，在斑馬魚(yú)、爪蟾和小鼠胚胎發(fā)生過(guò)程中，增強(qiáng)子的去甲基化和染色質(zhì)打開(kāi)的整體動(dòng)態(tài)是保守的。與這些數(shù)據(jù)一致，在量化分化程度更高的組織（E10.5中腦、E12.5腸和E10.5心臟）中細(xì)胞譜系增強(qiáng)子的H3K27ac水平時(shí)，研究人員觀察到大量增強(qiáng)子被H3K27ac標(biāo)記。這表明增強(qiáng)子在E7.5建立，并將在很大程度上得到保持。與中胚層和內(nèi)胚層增強(qiáng)子相反，外胚層增強(qiáng)子早在E4.5的表皮細(xì)胞中就已打開(kāi)并去甲基化（圖3）。在中胚層命運(yùn)的細(xì)胞中，外胚層增強(qiáng)子才被部分抑制。當(dāng)檢測(cè)包含外胚層轉(zhuǎn)錄因子（SOX2和SP8）的motif位點(diǎn)的可及性動(dòng)態(tài)時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)這些motif已經(jīng)在表皮細(xì)胞中可及，并且由于中胚層的參與而失去可及性。相反，與內(nèi)胚層和中胚層轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的motif只有在E7.5時(shí)才能在其各自的細(xì)胞譜系中可及。這些結(jié)果可以通過(guò)在外胚層中活化外胚層標(biāo)記基因或在外胚層中維持多能性標(biāo)記基因來(lái)解釋。為了對(duì)此進(jìn)行研究，將E7.5的增強(qiáng)子注釋與已報(bào)道的胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）和E10.5中腦的H3K27ac ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行重疊。E7.5外胚層增強(qiáng)子顯示出幾乎所有的多能或神經(jīng)信號(hào)，并具有明顯不同的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性動(dòng)態(tài)。多能性增強(qiáng)子顯示甲基化增加，可及性隨時(shí)間降低，這表明這些增強(qiáng)子的抑制與多能性基因啟動(dòng)子的動(dòng)態(tài)相似（圖1g，h）。相比之下，神經(jīng)外胚層增強(qiáng)子從E4.5保持低甲基化及可及性狀態(tài)。最后，為了推斷增強(qiáng)子激活的時(shí)間依賴性，使用RNA表達(dá)譜對(duì)中胚層和內(nèi)胚層的兩條細(xì)胞軌跡進(jìn)行排序。通過(guò)繪制每類細(xì)胞譜系增強(qiáng)子的平均DNA甲基化和染色質(zhì)可及性，發(fā)現(xiàn)外胚層增強(qiáng)子的甲基化增益（和可及性喪失）先于中胚層和內(nèi)胚層增強(qiáng)子的去甲基化（和可及性增益）。在這兩種情況下，同時(shí)發(fā)生甲基化和可及性的變化，表明兩個(gè)表觀遺傳胚層的緊密調(diào)控。
圖3 發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞譜系增強(qiáng)子的DNA甲基化和染色質(zhì)可及性動(dòng)態(tài)。
TET酶介導(dǎo)增強(qiáng)子去甲基化TET甲基胞嘧啶雙加氧酶已被報(bào)道與增強(qiáng)子的去甲基化有關(guān)，功能喪失實(shí)驗(yàn)表明TET酶對(duì)于原腸胚形成至關(guān)重要。為了檢測(cè)TET酶是否介導(dǎo)細(xì)胞譜系特異性去甲基化，研究者將野生型ES細(xì)胞和所有三種TET酶（Tet TKO）敲除的ES細(xì)胞都分化成胚體，并使用單細(xì)胞核小體甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scNMT-seq）分析了這些細(xì)胞。將RNA表達(dá)圖譜映射到體內(nèi)原腸胚圖譜，顯示野生型胚體概括了從分化第2天的多能表皮細(xì)胞向第4天到第5天之間的原條的過(guò)渡（圖4a，b）。在第6和第7天，觀察到了成熟的中胚層結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，包括造血細(xì)胞類型（圖4a，b）。標(biāo)記基因在預(yù)期的細(xì)胞譜系中表達(dá)，細(xì)胞譜系之間的差異表達(dá)與體內(nèi)結(jié)果相符。此外，野生型胚體中DNA甲基化和染色質(zhì)可及性的整體動(dòng)態(tài)基本反映了體內(nèi)數(shù)據(jù)。在第2天，在表皮樣細(xì)胞中Tet TKO分化與野生型的比較，顯示Tet TKO細(xì)胞中外胚層增強(qiáng)子較高的DNA甲基化，但中胚層或內(nèi)胚層增強(qiáng)子無(wú)差異（圖4c）。Tet TKO胚胎的甲基化的重新分析證實(shí)了在體內(nèi)觀察到相同的模式。去甲基化的受損還與分化時(shí)間的差異有關(guān)，Tet TKO細(xì)胞在第4至5天顯示出早期中胚層分化的比例增加（圖4a，b）。然而，在第6至7天，Tet TKO細(xì)胞不能適當(dāng)?shù)厝ゼ谆?/span>細(xì)胞譜系特異性增強(qiáng)子，也不能分化為成熟的中胚層細(xì)胞類型（圖4c）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞譜系增強(qiáng)子的去甲基化至少部分地由TET酶介導(dǎo)。盡管早期中胚層似乎不需要增強(qiáng)子去甲基化，但是Tet TKO細(xì)胞中缺乏造血細(xì)胞表明去甲基化對(duì)于隨后的細(xì)胞譜系發(fā)育可能是重要的。Tet TKO胚胎能夠啟動(dòng)原腸胚形成，但是它們?cè)?/span>E8.5中胚層衍生的細(xì)胞類型（包括心臟或體節(jié)）中顯示出缺陷。
圖4 TET酶是中胚層增強(qiáng)子的去甲基化以及隨后胚體血細(xì)胞分化所必需的。
研究結(jié)果表明，多能表皮細(xì)胞早在E4.5時(shí)就被表觀遺傳的外胚層活化。這一發(fā)現(xiàn)支持了Waddington等人的表觀遺傳模型中“默認(rèn)”路徑的存在，為ES細(xì)胞的神經(jīng)外胚層組織“默認(rèn)”分化的現(xiàn)象提供了潛在的機(jī)制。相比之下，內(nèi)胚層和中胚層通過(guò)相應(yīng)增強(qiáng)子的去甲基化和染色質(zhì)打開(kāi)而主動(dòng)地偏離默認(rèn)路徑。因此，胚層表觀基因組是在原腸胚中通過(guò)分層或非對(duì)稱表觀遺傳模型界定（圖3a）。 總之，這些結(jié)果對(duì)表觀基因組在細(xì)胞譜系中的作用具有重要意義。可推測(cè)，不對(duì)稱的表觀遺傳活化以及早期祖細(xì)胞被表觀遺傳默認(rèn)的細(xì)胞類型活化可能是體內(nèi)細(xì)胞譜系的一個(gè)更普遍的特征。與這一假設(shè)一致，最近的兩項(xiàng)研究鑒定了前腸和成骨的默認(rèn)信號(hào)通路。未來(lái)使用多組學(xué)方法研究細(xì)胞群體的研究有可能改變我們對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的理解，這對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)具有重要意義。
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