摘要

抗體及抗體樣Fc融合蛋白已近成功用于癌癥治療，過繼性免疫治療感染，成癮，以及自身免疫性疾病。通常這些生物藥用于阻斷蛋白質(zhì)之間的相互作用，涉及宿主受體與誘導(dǎo)信號(hào)的作用，重新招募效應(yīng)細(xì)胞到靶細(xì)胞周圍，以及固定補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白等等。由于抗體在感染和遺傳性疾病治療方面巨大的潛能，眾多的研究致力于提高抗體效能和特異性功能方面。而抗原抗體之間的相互作用也顯得尤為重要，其重要性不亞于抗體鉸鏈區(qū)及重鏈恒定區(qū)在抗體發(fā)揮功能中的作用?？贵w鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)通過結(jié)合宿主受體或補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)效應(yīng)功能及調(diào)節(jié)抗體的循環(huán)。分子水平及結(jié)構(gòu)分析研究已經(jīng)揭示了不同種屬，不同亞類抗體鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)如何識(shí)別宿主受體及補(bǔ)體蛋白的作用機(jī)制。分子層面的詳細(xì)解讀使得人們可以通過干預(yù)鉸鏈區(qū)及恒定區(qū)序列，糖基化修飾達(dá)到增強(qiáng)或降低抗體效應(yīng)功能和改變抗體半衰期的目的。本文著重描述概念層面上對(duì)抗體鉸鏈區(qū)，F(xiàn)c區(qū)優(yōu)化，并描述相應(yīng)的優(yōu)化介導(dǎo)的抗體生物學(xué)效應(yīng)以及潛在的臨床疾病治療應(yīng)用價(jià)值。

背景

自1986年第一款單克隆抗體藥物經(jīng)FDA獲準(zhǔn)上市，抗體及抗體衍生物藥物快速增長，截止2015年有44款抗體藥物在美國和歐洲獲準(zhǔn)上市。與預(yù)期一致的是抗體藥保持著每年新增6-9種的速度，目前已攀升多達(dá)70多種。預(yù)計(jì)在接下來的幾年內(nèi)全球基于抗體的治療藥物銷售額將達(dá)到600-750億美元。因此，很多制藥企業(yè)涉足抗體樣分子并以此作為他們收入及當(dāng)?shù)囟愂盏脑鲩L點(diǎn)。

基礎(chǔ)科學(xué)持續(xù)致力于基因紊亂，癌癥，感染性疾病的發(fā)病機(jī)制研究，發(fā)病機(jī)制的深入研究助力基于抗體的生物藥抵消這些非正常生物進(jìn)程中的作用，起到臨床治療的效果?？贵w如何抵消這些非正常生物學(xué)進(jìn)程可以通過優(yōu)化選擇那些經(jīng)過序列修飾的抗體分子進(jìn)一步增強(qiáng)或者廢除它們與宿主免疫系統(tǒng)的作用來達(dá)到。企業(yè)及科研實(shí)驗(yàn)室關(guān)于抗體修飾的概念論證是走向應(yīng)用的基礎(chǔ)。很多獲準(zhǔn)上市的抗體包括傳統(tǒng)意義上經(jīng)典的單克隆抗體以及經(jīng)過優(yōu)化的抗體像Orencia R (abatacept),Soliris (eculizumab), Nplate (romiplostim), 和Removab 都是已證實(shí)有效的優(yōu)化抗體治療藥物。

為了優(yōu)化抗體功能，從業(yè)者需要對(duì)抗體的構(gòu)造，以及組成元件的作用深入了解。一個(gè)完整的抗體分子包含兩條50KDa的重鏈和兩條25KDa的輕鏈，組成150KDa的可溶性的免疫球蛋白。每條重鏈和輕鏈之間通過二硫鍵以及非共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的異二聚體，兩個(gè)異二聚體之間通過重鏈之間的二硫鍵形成完整的抗體。每條重鏈和輕鏈形成的異二聚體包含抗原結(jié)合片段Fab,鉸鏈區(qū)，F(xiàn)c組成。鉸鏈區(qū)又分為上，下，和核心區(qū)，F(xiàn)c片段包含重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。

抗體的恒定區(qū)也有助于抗體重鏈序列的變化?？贵w重鏈可變區(qū)結(jié)合抗體重鏈恒定區(qū)構(gòu)成完整的抗體重鏈。依據(jù)重鏈恒定區(qū)α，μ，γ，ε，δ的不同，結(jié)合可變區(qū)抗體分為不同的類型。在人類中，依據(jù)γ基因片段的不同又分為IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 4個(gè)亞類，而它們的相似程度高達(dá)90%。臨床上，每個(gè)亞類專職清除著不同病原體。例如，IgG2缺陷與莢膜病菌感染有關(guān)。其分子機(jī)制可能是個(gè)體缺乏IgG2類抗體對(duì)致病菌多糖的清除減弱?？贵wFc的工程化，對(duì)不同類型，不同亞型的抗體優(yōu)化非常重要，其原因在于序列的變化決定了抗體與受體FcRn,FcαR,FcγR,以及補(bǔ)體蛋白C1q的親和力和特異性。其中FcγRs中有5類通過結(jié)合IgG來激活效應(yīng)細(xì)胞,這些激活受體型包括FcγRⅠ,FcγRⅡa,FcγRⅡc,FcγRⅢa,FcγR,Ⅲb5類激活性受體,和1類抑制型FcγR——FcγRⅡb。FcγRs具有多態(tài)性，某些等位基因?qū)τ贔c有高度親和力，例如FcγRⅢa中V158與F158相比對(duì)IgG1 Fc有更高的親和力?？贵w結(jié)合與這些受體可以有效募集效應(yīng)細(xì)胞靶向靶細(xì)胞或者病原體并對(duì)其清除（圖1A）。因此，對(duì)于Fc以及鉸鏈區(qū)序列突變和翻譯后修飾的改變賦予抗體及其抗體樣蛋白在效應(yīng)功能及體內(nèi)循環(huán)半衰期上的改變。除了序列突變，F(xiàn)c區(qū)含有一個(gè)297位N-連接的糖基化位點(diǎn)，這對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能都很重要。大多數(shù)已獲準(zhǔn)的臨床抗體藥為IgG,其亞型多數(shù)為IgG1,目前有3款I(lǐng)gG2類型的抗體藥在美國上市，IgG3含有較長的鉸鏈區(qū)容易被蛋白酶切割，以及相對(duì)于其它亞型較短的半衰期。由于這些原因IgG3類抗體還未作為治療型抗體的亞型。由于絕大多數(shù)臨床獲準(zhǔn)抗體藥物為IgG類，優(yōu)化IgG與FcγR的結(jié)合主要集中在Fc的工程化優(yōu)化上。然而，其他類型抗體如IgA,IgM,IgE類抗體由于也具有跟Fc受體的相互作用，所以值得關(guān)注，文章后面會(huì)介紹到在Fc工程化中的應(yīng)用。

本文主介紹對(duì)于Fc與其作用蛋白之間相互作用的優(yōu)化或者減弱的一些方法的應(yīng)用。文章集中介紹Fc序列改變，糖基化改變，從而達(dá)到改變Fc引起的效應(yīng)功能，F(xiàn)c的優(yōu)化主要集中在單點(diǎn)突變引起的加強(qiáng)或者消除Fc與受體的結(jié)合，或者二者兼有，通過本文的學(xué)習(xí)，獲取一些關(guān)于Fc選擇及改造的相關(guān)知識(shí)。

圖1.基于抗體的藥物應(yīng)用

抗體Fc突變引起的效應(yīng)功能增強(qiáng)

增強(qiáng)FcγR的結(jié)合

與FcγR的結(jié)合，是抗體行駛其效應(yīng)功能所必需的，例如抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC）,抗體依賴的細(xì)胞吞噬（ADCP），以下描述的是Fc優(yōu)化影響與FcγR結(jié)合引起的ADCC與ADCP的增強(qiáng)。

點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)與FcγR的結(jié)合

已經(jīng)有多種方法嘗試優(yōu)化抗體的Fc來增加它與相應(yīng)的FcγR的結(jié)合（表1和圖2）。Shields et al 等人通過丙氨酸掃描確定Fc暴露氨基酸殘留的相應(yīng)位點(diǎn)，其指導(dǎo)原則為IgG1 Fc結(jié)構(gòu)改變不超過3.2?。Fc丙氨酸突變的篩選主要依靠與FcγRⅠ,FcγRⅡa,FcγRⅡb,FcγRⅢa和FcRn的結(jié)合，這些點(diǎn)突變可以劃分為增強(qiáng)或者減弱與FcγR和FcRn結(jié)合兩類。27個(gè)獨(dú)特突變顯著增加了FcγR和FcRn中1類受體的增強(qiáng)結(jié)合。為了試圖工程化Fc達(dá)到與介導(dǎo)ADCC效應(yīng)的FcγRⅢa的強(qiáng)結(jié)合，丙氨酸掃描突變結(jié)合了不止一個(gè)突變位點(diǎn)。一個(gè)組合突變Ser298Ala, Glu333Ala,和 Lys334Ala ，也稱作AAA突變，可以顯著增強(qiáng)IgG1與FcγRⅢa的結(jié)合（表1），與FcγRⅢa結(jié)合的增強(qiáng)使得擁有AAA突變的Herceptin 在體外殺傷Her2+細(xì)胞的殺傷效果提升了50-100倍。

在一個(gè)直接的評(píng)估方法中，Lazar et al等人用計(jì)算機(jī)輔助測(cè)算氨基酸替代對(duì)于Fc與FcγRⅢa相互作用的提高。他們也得出了一系列高質(zhì)量的突變顯著提高抗體的穩(wěn)定性和可溶性，與野生型Fc相比，Ser239Asp 和Ile332Glu 單點(diǎn)突變可以將Fc與FcγRⅢa的結(jié)合提高1個(gè)數(shù)量級(jí)（如圖2A），為了Fc與FcγRⅢa的結(jié)合最大化，將Ser239Asp 和Ile332Glu 兩個(gè)單點(diǎn)突變結(jié)合，雙點(diǎn)突變將Fc與FcγRⅢa的結(jié)合提高2個(gè)數(shù)量級(jí)（如圖2A）。然而，Ser239Asp 和Ile332Glu 雙突變也增加了與抑制性受體FcγRⅡb的結(jié)合。這一不太令人滿意的負(fù)面效應(yīng)可以通過增加Ala330Leu 突變形成Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu 突變部分的抵消掉。Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu通常稱作DLE突變已經(jīng)被引入抗癌藥物Trastuzumab 的Fc中。與野生型Trastuzumab相比，引入DLE突變的抗體藥引起的ADCC效應(yīng)殺傷HER2+的癌細(xì)胞，無論在低表達(dá)還是高表達(dá)HER2+癌細(xì)胞,其殺傷效果都提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。DLE突變也增強(qiáng)了整合素抗體體藥物MEDI-522 ADCC作用,針對(duì)黑色素瘤的殺傷效果顯著提高。類似的，該突變還增強(qiáng)了針對(duì)CD20抗體藥物Rituximab的ADCP抗腫瘤作用。

表1.Fc修飾增強(qiáng)抗體效應(yīng)功能

在細(xì)胞水平上，DLE突變抗體相對(duì)于野生型抗體可以招募更多的NK細(xì)胞到抗體包裹的靶細(xì)胞周圍。接近90%的招募NK細(xì)胞參與到除此相互作用的靶細(xì)胞殺傷中，隨后移動(dòng)到其他可以相互作用的靶細(xì)胞周圍參與殺傷。因此，隨著時(shí)間的推移，單個(gè)NK細(xì)胞可以殺傷眾多的相互作用靶細(xì)胞殺。這種DLE優(yōu)化的抗體逐漸增加招募NK細(xì)胞有效殺傷靶細(xì)胞的作用機(jī)制歸因于增加了FcγRⅢ介導(dǎo)的信號(hào)，主要體現(xiàn)在ZAP70的磷酸化，以及引起的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

包含Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu (DLE突變)的Fc晶體結(jié)構(gòu)解釋了突變引起的Fc對(duì)FcγRⅢa結(jié)合的影響。結(jié)構(gòu)顯示突變的Fc在構(gòu)象上呈開放狀態(tài)，與野生型Fc相比，突變的Fc兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間的距離增加了30 ?。熱穩(wěn)定性測(cè)定顯示打開狀態(tài)的CH2結(jié)構(gòu)域使得CH2結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性降低，DLE突變使CH2結(jié)構(gòu)更加靈活。優(yōu)化的Fc與FcγRⅢa相互作用模型用來篩選評(píng)價(jià)DLE突變能否增加Fc與FcγRⅢa相互作用。的確，從結(jié)構(gòu)上顯示，Ser239Asp/Ile332Glu突變?cè)黾恿薋c與FcγRⅢa上Lys158形成額外的氫鍵，Ala330Leu突變?cè)黾恿薋c與FcγRⅢa上Ile85的氫鍵。另外，結(jié)構(gòu)模型也顯示二者之間的靜電作用以及疏水作用力都有所增加。

Mimoto et al.等人設(shè)計(jì)了非對(duì)稱的Fc優(yōu)化結(jié)構(gòu)結(jié)合DLE突變形成了新的Fc優(yōu)化結(jié)構(gòu)，在大量的突變篩選中，他們加測(cè)了1000多個(gè)Fc單點(diǎn)突變,結(jié)果顯示那些增加了與FcγRⅢa結(jié)合的突變，僅僅需要突變IgG重鏈就可以實(shí)現(xiàn)。他們從整合進(jìn)重鏈恒定區(qū)突變庫中選擇出了3個(gè)點(diǎn)突變Leu234Tyr, Gly236Trp, 和 Ser298Ala（稱作YWA突變）。鑒于DLE已經(jīng)被證實(shí)顯著增加Fc與FcγRⅢa的結(jié)合，他們將篩選到的突變整合進(jìn)另一條抗體重鏈的恒定區(qū)。因此，抗體一條重鏈的恒定區(qū)包含YWA突變，另一條重鏈恒定區(qū)整合進(jìn)了DLE突變。體外ADCC實(shí)驗(yàn)顯示這樣非對(duì)稱組合顯著強(qiáng)于對(duì)稱的YWA突變和DLE突變結(jié)構(gòu)。因此，這樣的Fc非對(duì)稱結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使得人們可以將多個(gè)優(yōu)化突變整合進(jìn)兩條重鏈以增強(qiáng)Fc功能。

巨噬細(xì)胞通過FcγRⅡa參與抗體介導(dǎo)的吞噬作用。為了增加抗體與FcγRⅡa的相互作用Richards et al.篩選了900多個(gè)Fc突變體與FcγRⅡa相互作用，鑒定發(fā)現(xiàn)Gly236Ala突變使得Fc與FcγRⅡa結(jié)合增加了近6倍，無論等位基因131位是His,還是Arg。不幸的是，Gly236Ala在增加了Fc與FcγRⅡa相互作用的同時(shí)，卻降低了IgG1與激活型受體FcγRⅠ的結(jié)合。為了恢復(fù)與FcγRⅠ的相互作用，先前的Ser239Asp/Ile332Glu突變被引進(jìn)入IgG1 Fc,這個(gè)組合型的3點(diǎn)突變使Fc與FcγRⅠ結(jié)合增加了近3倍，與FcγRⅡa相互作用增加了70倍，與FcγRⅢa的相互作用也增加了31倍。Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala突變體外實(shí)驗(yàn)顯示增加了FcγRⅡa依賴的吞噬作用以及FcγRⅢa依賴的ADCC作用，這些作用都有助于IgG1型抗體藥物殺傷惡性腺癌細(xì)胞。

激活性受體FcγRⅡa與抑制性受體FcγRⅡb相似度高達(dá)90%，因此，在Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala三點(diǎn)突變引起Fc與FcγRⅠ和FcγRⅢa相互作用增加的同時(shí)，也使得Fc與FcγRⅡb相互作用也提高了13倍。為了比較突變導(dǎo)致的Fc與激活型受體的結(jié)合和Fc與抑制性受體的結(jié)合誰將占據(jù)主導(dǎo)地位，結(jié)果顯示，無論是Gly236Ala單點(diǎn)突變，還是Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala三點(diǎn)突變與激活性受體FcγRⅡa的相互作用都顯著強(qiáng)于與抑制性受體FcγRⅡb相互作用。因此，占據(jù)主導(dǎo)地位的Ser239Asp/Ile332Glu/Gly236Ala三點(diǎn)突變最終決定了抗體的功能。Smith et a等人試圖進(jìn)一步提升Fc與FcγRⅡa的相互作用，于是結(jié)合了一系列突變產(chǎn)生了Gly236Ala/Ser239Asp/Ala330Leu/Ile332Glu突變，稱作GASDALIE突變。這個(gè)集合突變是本來野生型Fc與等位基因158位為F的FcγRⅢa弱結(jié)合提升了30倍，這很可能是由于Fc突變體與FcγRⅢa靜電引力增加的緣故。類似的，該組合型突變相應(yīng)增加了Fc與FcγRⅡa的相互作用近25倍，但是與FcγRⅡb親和力的增加并不明顯，這使得突變的Fc與FcγRⅡa的結(jié)合以及Fc與FcγRⅡb結(jié)合的比例從野生型Fc與二者結(jié)合比例的1.6倍提升到11.6倍。在第二類實(shí)驗(yàn)中，科學(xué)家專注于優(yōu)化Fc使其突變體避免增加與FcγRⅡb的結(jié)合。借助于酵母展示系統(tǒng)，科學(xué)家篩選鑒定那些增加與FcγRⅢa相互作用，減少與FcγRⅡb相互作用的突變。通過酵母展示系統(tǒng)，將這些突變體展示于酵母表面，首先將與FcγRⅡb beads相互作用的Fc淘汰掉，將淘選的文庫再去與FcγRⅢa beads結(jié)合，通過兩級(jí)不同的文庫淘選，最終篩選到7個(gè)點(diǎn)突變個(gè)體缺乏與FcγRⅡb的結(jié)合，卻增加了與FcγRⅢa結(jié)合的Fc突變。這些突變隨后被逐個(gè)或者組合引入IgG1的Fc中。組合Phe243Leu, Arg292Pro, Tyr300Leu, Val305Ile, 和Pro396Leu的突變Fc顯示與FcγRⅡa, FcγRⅢa解離速率相對(duì)于野生型Fc顯著降低，同時(shí)也沒有增加與FcγRⅡb受體的結(jié)合，包含5個(gè)突變的Fc被稱作18突變體，該突變與FcγRⅡa, FcγRⅢa的相互作用增加了10倍，與FcγRⅡb相互作用提高了不到2倍。體外試驗(yàn)顯示，18突變使7種抗體藥對(duì)結(jié)腸癌，卵巢癌，乳腺癌有很強(qiáng)的ADCC殺傷效應(yīng)。在動(dòng)物模型上Phe243Leu, Arg292Pro, Tyr300Leu, Val305Ile, 和Pro396Leu的突變的IgG1抗體藥顯著增加了卵巢轉(zhuǎn)移癌小鼠模型的存活率。這些突變已經(jīng)在人類癌癥治療中得到了證實(shí)，包含18突變的HER2單克隆抗體藥相對(duì)于trastuzumab ADCC作用有了顯著提高。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中在接受Margetuximab治療，78%響應(yīng)患者中腫瘤體積相對(duì)縮小，顯示該優(yōu)化突變具有潛在的改善療效的作用。

圖2.提高抗體Fc介導(dǎo)功能的策略

糖基化工程改善抗體與FcγR結(jié)合

IgG1 的Fc在297位上含有1個(gè)N連接的糖基化位點(diǎn)。N297位上的寡糖通常有兩種N-乙酰葡萄糖胺構(gòu)成，三種甘露糖，多與兩個(gè)的乙酰葡萄糖胺連接著甘露糖形成雙叉寡糖復(fù)合體。兩個(gè)乙酰葡聚糖胺通過β1,2與甘露糖通過α-3 或 α-6 相連。因此，每個(gè)臂上的寡糖依據(jù)GlcNAc2上甘露糖連接方式不同區(qū)分為α1,3或α1,6寡糖。另外，巖藻糖，半乳糖，唾液酸，N乙酰葡萄糖胺都可以添加在寡糖核心結(jié)構(gòu)上（如圖2B）。人類血液中循環(huán)的IgG通常為巖藻糖化的，然而，重組抗體在植物中表達(dá)，基因工程方法敲入，敲出特異性的糖基化酶，或者在體外通過酶消化都可以改變重組抗體的糖基化形式（如圖2B）。因?yàn)榭贵w重鏈的兩條重鏈都可以糖基化，因此，在單抗體分子中有可能也存在著明顯的寡糖異質(zhì)性。寡糖可以直接影響Fc與FcγR的結(jié)合。Fc上Asn297的寡糖與FcγRⅢa由于存在空間位阻，阻礙了Fc與FcγRⅢa的結(jié)合，從而導(dǎo)致了抗體介導(dǎo)的ADCC作用降低。核磁共振顯示，在FcAsn297含有不同的寡糖時(shí)，其鉸鏈區(qū)的構(gòu)象存在著差異。因?yàn)榭贵w的鉸鏈區(qū)與FcγR相互作用。所以N297位的糖基化間接影響了Fc與FcγR相互作用。也因此，F(xiàn)c糖基化的優(yōu)化對(duì)抗體生物學(xué)功能優(yōu)化非常有意義。

為了調(diào)節(jié)抗體的活性，一些研究專注于抗體的糖基化修飾，通過宿主細(xì)胞糖基化酶的表達(dá)或者抑制調(diào)節(jié)重組抗體的糖基化。在表達(dá)β(1,4)-Nacetylglucosaminyltransferase III的宿主細(xì)胞中表達(dá)重組抗體，將產(chǎn)生具有更好ADCC效應(yīng)含有N297雙叉糖基化的重組抗體。Davies et al.等人用此方法產(chǎn)生的CD20抗體增加了與FcγRⅢa相互作用，抗體藥對(duì)通過依賴FcγRⅢa對(duì)CD20+細(xì)胞殺傷作用提升了10-20倍。盡管對(duì)平分的N乙酰葡糖胺糖基化引起抗體效能的提高存在著爭(zhēng)議，這里存在另一種假設(shè)，移除巖藻糖有助于提高抗體效能（圖2B）?？贵w巖藻糖缺陷已經(jīng)被證實(shí)對(duì)FcγRⅢa的相互作用提升了50倍，ADCC作用也顯著增強(qiáng)。相對(duì)于F158的FcγRⅢa，去巖藻糖化抗體Fc與V158的FcγRⅢa有極高的結(jié)合力。去巖藻糖基化抗體相對(duì)于巖藻糖基化抗體與兩種等位基因差異的FcγRⅢa相互作用都有所增強(qiáng)。這種去鹽藻糖基化抗體顯著增加與糖基化FcγRⅢa的結(jié)合，當(dāng)FcγRⅢa 移除掉Asn162位糖基化位點(diǎn)后，由去巖藻糖基化引起的抗體與FcγRⅢa結(jié)合作用的增強(qiáng)被抵消廢除。其機(jī)制是糖基化FcγRⅢ的結(jié)構(gòu)決定了其識(shí)別作用，抗體Asn297位去鹽藻糖化的寡糖作用于FcγRⅢa Asn162位的寡糖。Fc寡糖中的巖藻糖與FcγRⅢa 中的GlcNAc2存在空間位阻，這就從結(jié)構(gòu)上解釋了去巖藻糖化抗體為什么可以增強(qiáng)與FcγRⅢa的相互作用。mogamulizumab(POTELIGEO R )是第一個(gè)在日本獲準(zhǔn)上市的通過去巖藻糖基化增強(qiáng)ADCC作用的抗體藥物。

通過交換不同抗體亞型Fc結(jié)構(gòu)域增加與FcγR的結(jié)合（亞型交叉抗體）

除了引入突變和改變糖基化修飾增加抗體與受體的親和力。Fc可以被優(yōu)化到與廣泛的Fc受體結(jié)合（圖2C）。如前所述，除了FcγR,還多種Fc受體亞型廣泛存在與特異的白細(xì)胞表面。為了創(chuàng)造可以結(jié)合多種Fc受體(FcγR和FcαRⅠ)的Fc,一種新穎的抗體被開發(fā)出來作用于效應(yīng)細(xì)胞。中性粒細(xì)胞是機(jī)體最豐富的白細(xì)胞，他們通過FcαRⅠ與IgA抗體的Fc相互作用。IgA2的一個(gè)結(jié)構(gòu)域被添加在IgG1的恒定區(qū)構(gòu)成了新的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CH1g-CH2g-CH3g-CH3a)，該抗體可以與FcγRs和FcαRⅠ結(jié)合。為了使恒定區(qū)更接近于IgA恒定區(qū)，IgG恒定區(qū)的CH1結(jié)構(gòu)域被IgA的CH1結(jié)構(gòu)與替換，形成CH1a-CH2gCH3g-CH3a的恒定區(qū)。這種四結(jié)構(gòu)域交叉結(jié)合形成的IgGA嵌合抗體結(jié)合了類似于IgA2的J鏈降低了與多聚Ig受體的結(jié)合。該四結(jié)構(gòu)域交叉抗體也降低了與FcγR1的親和力3-5倍，而且抗體的血清半衰期相對(duì)于IgG1也有所降低。盡管有諸多缺點(diǎn)，四結(jié)構(gòu)域交叉IgGA嵌合抗體可以介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的綿陽紅細(xì)胞裂解作用和相對(duì)于IgG1良好的PH耐受性。類似的，第二種交叉類型Fc抗體創(chuàng)造了出來，該抗體融合了IgG1的CH1和IgA的α恒定區(qū)，形成串聯(lián)的G1-A結(jié)構(gòu)，在設(shè)計(jì)上IgA2的鉸鏈區(qū)，CH2,CH3融合在IgG1的C端。該交叉串聯(lián)的IgG/IgA設(shè)計(jì)與IgG1有類似的表達(dá)水品，抗原結(jié)合力，熱穩(wěn)定性等。在體外，該交叉串聯(lián)的IgG/IgA與野生型的IgG和IgA對(duì)FcαRI and FcγRI, FcγRII, FcγRIIIa,和 FcRn有類似的親和力。這種與多種FcRs的結(jié)合介導(dǎo)多核細(xì)胞，NK細(xì)胞抗體依賴的ADCC作用。串聯(lián)交叉的IgG/IgA抗體與C1q的結(jié)合相對(duì)于IgG1與C1q的結(jié)合降低3倍。最近，在BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)中，串聯(lián)交叉的IgG/IgA循環(huán)半衰期類似于IgG1。在第3種設(shè)計(jì)中，Kelton et al設(shè)計(jì)了一種交叉抗體用α恒定區(qū)交換了CH3和CH2結(jié)構(gòu)域及CH1 α1 loop245-258殘基(PKPKDTLMISRTPE（圖2C）。這種嵌合抗體可以與FcγRI, FcγRIIa, 和FcαRI相結(jié)合。IgGA嵌合抗體可以介導(dǎo)多核細(xì)胞引起ADCC效應(yīng)，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞引起ADCP作用以及激活補(bǔ)體反應(yīng)。然而，這種設(shè)計(jì)缺少抗體與FcRn的結(jié)合來調(diào)節(jié)抗體的半衰期。因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化以提高抗體在體內(nèi)的效應(yīng)功能。最后，展示出該設(shè)計(jì)概念在廣泛的效應(yīng)細(xì)胞中具有普遍的適用性。

IgG多聚化以提高與FcγR的結(jié)合

多聚化的IgG在自身免疫性疾病治療方面顯示出良好的療效。IgG多聚化可以通過多種形式實(shí)現(xiàn)，像添加異質(zhì)性多聚化的異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。另一個(gè)鉸鏈區(qū)序列添加在天然鉸鏈區(qū)的C端或者CH3結(jié)構(gòu)域的C端。類似的，通過在IgG1的C端加上了IgM的尾部或者在309位引入Cys突變形成IgG 6聚體。通過引入IgM尾部形成的IgG多聚體增強(qiáng)了與FcγRI, FcγRIIa, 和FcγRIIIa的相互作用，與FcγRIIb 和 FcγRIIIb的相互作用減弱了。在眾多差異的多聚化設(shè)計(jì)中，多聚IgG與單體形式相比顯著提高了與FcγRI, FcγRIIb, 和 FcγRIII的相互作用。一些分子在臨床關(guān)節(jié)炎模型，神經(jīng)性病變，及自身免疫造成的重度肌無力治療中展示出良好的治療前景。因此，多聚IgG設(shè)計(jì)可以通過進(jìn)一步優(yōu)化使得其可以與FcRn結(jié)合以增加半衰期，延長藥物作用時(shí)間，將更具潛力。

增強(qiáng)補(bǔ)體固定作用

點(diǎn)突變提高與C1q的結(jié)合以及增強(qiáng)補(bǔ)體依賴的殺傷作用

抗體可以通過補(bǔ)體途徑執(zhí)行殺傷效應(yīng)。依賴補(bǔ)體的殺傷作用第一步是已結(jié)合抗原的抗體通過CH2結(jié)合于補(bǔ)體蛋白C1q。丙氨酸突變掃描顯示人類IgG1 Fc段的Asp270, Lys322, Pro329, 和Pro331是Fc結(jié)合C1q的必需氨基酸位點(diǎn)。盡管不同物種中Fc與C1q結(jié)合的必需氨基酸之間存在差異。為了提高Fc與C1q的結(jié)合，Idusogie et al.等人鑒定出Fc中接近Fc與C1q結(jié)合核心區(qū)域的近端氨基酸為Lys326和Glu333，這些氨基酸也是第一次通過丙氨酸突變掃描首次發(fā)現(xiàn)。引入Lys326Ala 和 Glu333Ala突變?cè)黾恿薋c與C1q的結(jié)合，CDC作用也提高了50%。為了優(yōu)化Fc與C1q結(jié)合，在326和333位單獨(dú)或者引入不同的氨基酸突變。其中，組合突變Lys326Trp 和Glu333Ser將Fc與C1q的結(jié)合提高了5倍。然而由該組合突變引起的CDC作用于Lys326Trp單點(diǎn)突變引起的相同，并且Fc也失去了介導(dǎo)ADCC的作用。在將326,333位突變?yōu)閮蓚€(gè)Ala,或者將326,333分別突變?yōu)長ys326Met，Glu333Ser在增加了CDC作用的同時(shí)并不妨礙ADCC作用。類似的突變被引入鉸鏈區(qū)看是否會(huì)影響Fc與C1q結(jié)合和CDC活性。鉸鏈區(qū)的突變并未直觀的觀察到影響C1q與處于鉸鏈區(qū)下游的CH2的結(jié)合。然而，上游鉸鏈區(qū)Trp替換222,223,224,225 4個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸，或者組合替換都相應(yīng)增加了Fc與C1q的結(jié)合以及CDC效應(yīng)。ADCC作用以及與FcγRIIIa的相互作用未受影響。Cys221Asp 和 Asp222Cys單獨(dú)突變或者結(jié)合Trp替代突變也增加了與C1q的結(jié)合以及CDC活性。因此，人類IgG1的鉸鏈區(qū)調(diào)節(jié)著CH2與C1q的結(jié)合。

為了探究其他突變是否可以增加IgG1的CDC作用，Moore et al.對(duì)CD20抗體Fc進(jìn)行了38種突變優(yōu)化并在體外通過抗體介導(dǎo)的CDC殺傷Raji細(xì)胞對(duì)抗體突變體進(jìn)行了篩選。在這38種突變中編碼Ser267Glu, His268Phe, 和Ser324Thr的3個(gè)點(diǎn)突變稱作EFT突變，該突變產(chǎn)生了更強(qiáng)的CDC作用。CDC最大的改善是將3個(gè)點(diǎn)突變整合進(jìn)1個(gè)Fc中。相關(guān)分析表明，3個(gè)點(diǎn)整合突變?cè)黾覥DC潛能歸因于增加了與C1q的結(jié)合。EFT 3點(diǎn)突變同時(shí)增加了Fc與FcγRIIb的結(jié)合，據(jù)此推斷，該突變限制了抗體的ADCC和ADCP作用。結(jié)合額外的增強(qiáng)ADCC和ADCP作用的突變與EFT突變可以將EFT突變引起的ADCC和ADCP作用的減弱恢復(fù)到野生型IgG1狀態(tài)，但并沒有提高。EFT突變引起的與FcγRIIb作用的增強(qiáng)可以通過引入Ser267Glu突變而減弱，然而引入該突變的影響是CDC作用的相應(yīng)減弱。His268Phe 和Ser324Thr突變結(jié)合提高ADCC,ADCP作用的突變創(chuàng)造出一個(gè)CDC,ADCC,ADCP作用都有所提升的Fc.該研究重點(diǎn)在于復(fù)雜的平衡在優(yōu)化一種效應(yīng)功能的同時(shí)不能減弱另一種效應(yīng)功能。

插入或缺失突變引起的與C1q結(jié)合增強(qiáng)及CDC作用的增強(qiáng)

鉸鏈區(qū)對(duì)于C1q識(shí)別抗體及抗體樣蛋白非常重要。IgG3含有不同于其他亞型抗體由重復(fù)的外顯子3編碼的較長的鉸鏈區(qū)。對(duì)于IgG3抗體激活補(bǔ)體反應(yīng)需要縮短其鉸鏈區(qū)。但是完全刪除鉸鏈區(qū)將廢除CDC功能，一個(gè)含有15個(gè)氨基酸殘基的鉸鏈區(qū)替代野生型IgG3鉸鏈區(qū)延伸的62個(gè)氨基酸將CDC作用提升了10倍。更特別的是從核心鉸鏈區(qū)移除3個(gè)重復(fù)區(qū)并不影響CDC作用，相反提高了抗體介導(dǎo)的CDC抗菌作用。與IgG3相比，在IgG1執(zhí)行核心鉸鏈區(qū)的兩個(gè)氨基酸的突變將減弱與C1q的結(jié)合，影響CDC,ADCC功能。

交叉抗體亞型提高與C1q的結(jié)合

IgG1在生物制藥中相對(duì)于IgG3更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)镮gG3較長的鉸鏈區(qū)使得大規(guī)模生產(chǎn)復(fù)雜化。然而在體外實(shí)驗(yàn)中，IgG3具有與C1q最好的結(jié)合。為了提高IgG1與C1q的結(jié)合，IgG3的結(jié)構(gòu)域被IgG1相關(guān)結(jié)構(gòu)域替代產(chǎn)生IgG1/IgG3交叉抗體。這種嵌合抗體由于較長的鉸鏈區(qū)使純化增加了難度，但是同時(shí)也增加了IgG3的功能。在一種最佳的突變中稱作1133，CH1和鉸鏈區(qū)來自于IgG1融合了IgG3的Fc。其ADCC作用和抗原結(jié)合能力未改變，而其CDC作用及與C1q的結(jié)合都有所增強(qiáng)。另外1133設(shè)計(jì)在低抗原水平下仍然保持著CDC作用。然而1133設(shè)計(jì)缺少與ProteinA的結(jié)合，這對(duì)抗體的純化增加了難度。因此，一種含有IgG1 CH1,鉸鏈區(qū)，CH3結(jié)構(gòu)域，IgG3 CH2結(jié)構(gòu)域的組合被設(shè)計(jì)了出來，因?yàn)镃1q結(jié)合于CH2結(jié)構(gòu)域而CH3與proteinA結(jié)合方便純化。該突變?cè)谠黾恿薈DC作用的同時(shí)還可以用proteinA純化。一種嵌合抗體增強(qiáng)CDC作用分子機(jī)制的假設(shè)是在CH2結(jié)構(gòu)域中近C1q結(jié)合端的氨基酸序列的差異造成Fc三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。在突變?cè)囼?yàn)中，旨在確定哪些氨基酸在IgG1,IgG3與C1q的結(jié)合中是必須的。K322被發(fā)現(xiàn)在兩種抗體與C1q結(jié)合中非常重要，但是在不同的抗體亞型中依賴不同的額外氨基酸。例如P331在IgG1執(zhí)行CDC作用中是必須的，但是在IgG3執(zhí)行CDC作用中影響就不那么明顯。這一結(jié)果揭示出C1q結(jié)合IgG3和IgG1存在差異，因此，嵌合抗體有可能提高Fc與C1q的結(jié)合。以上Fc設(shè)計(jì)的目的是增強(qiáng)IgG1的活性，而有些交叉將沉默F(xiàn)c的功能。與IgG1和IgG3相比，IgG2,IgG4介導(dǎo)的CDC作用微不足道。但是將IgG2中CH2結(jié)構(gòu)域用IgG3中相應(yīng)結(jié)構(gòu)域替代將給IgG2植入介導(dǎo)CDC作用的功能。類似的IgG4與IgG1在331位氨基酸存在著差異，這一位點(diǎn)接近C1q的結(jié)合位點(diǎn)，將IgG4中331位對(duì)應(yīng)的氨基酸用IgG1中331位氨基酸取代，將恢復(fù)IgG4介導(dǎo)的CDC作用到中等水平。因此，如果一個(gè)人知道介導(dǎo)效應(yīng)功能的關(guān)鍵氨基酸殘基，并將其引入功能沉默的Fc就會(huì)賦予抗體特殊的功能。

IgG1六聚化形式增強(qiáng)了與C1q結(jié)合和CDC作用

眾所周知，抗體與抗原結(jié)合形成聚體是增強(qiáng)與C1q結(jié)合的本質(zhì)。為了在缺少抗原結(jié)合時(shí)，讓IgG也能產(chǎn)生聚體，通過對(duì)IgG結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果顯示345位氨基酸殘基有助于不同亞型抗體多聚化。IgG結(jié)構(gòu)分析引入帶正電氨基酸有助于Fc與Fc相互作用。因此將Glu345Arg突變引入IgG1。電鏡，質(zhì)譜分析都顯示突變IgG1可以產(chǎn)生單體，也能產(chǎn)生聚體。聚體形式的IgG增強(qiáng)了與C1q的結(jié)合和更加有效地裂解淋巴瘤細(xì)胞。更有趣的是Glu345Arg突變不光增加了IgG1的CDC效應(yīng)，在IgG2,IgG3,IgG4中也是有效的。IgG1的多聚化也可以通過前面所述引入IgM抗體尾部氨基酸或者引入Cys309突變也可以實(shí)現(xiàn)。IgG尾部通過引入IgM尾部氨基酸形成聚體顯示可以有效增加與C1q以及C5b的結(jié)合。因此IgG多聚化是除了形成IgG1/IgG3嵌合抗體以外的另一種增加與C1q結(jié)合的方式。

糖基化改善補(bǔ)體結(jié)合

CH2結(jié)構(gòu)域中的Asn297糖基化修飾可以提高CDC作用。在大量篩選的20種異質(zhì)糖基化的抗三硝基苯酚的IgG1抗體， Fc過度糖基化增加了與C1q的結(jié)合和CDC活性。半乳糖基化出現(xiàn)在主要的寡糖殘基中影響CDC活性，很明顯，F(xiàn)c豐富的半乳糖基化與CDC正相關(guān)。在一項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中Peschke et al.運(yùn)用不同的特異性，多種亞型IgG抗體證實(shí)了半乳糖基化對(duì)CDC活性的影響。體外實(shí)驗(yàn)顯示半乳糖糖基化IgG1 抗體，CD20 Rituxumab顯著增強(qiáng)了CDC作用，有效殺傷Raji細(xì)胞。半乳糖糖基化IgG3 Fc也可有效增加抗體的CDC作用，但是在IgG2或IgG4并不適用。通過半乳糖糖基化Fc增加CDC作用并未改變抗體抗原的結(jié)合，而是增強(qiáng)了Fc與C1q的結(jié)合。IgG1的過度半乳糖糖基化同時(shí)也增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性（差示掃描量熱法）。因此，半乳糖基化Fc是提高產(chǎn)物熱穩(wěn)定性及CDC作用的策略。

提高抗體循環(huán)半衰期

除了通過增加與激活型受體FcγR,C1q的親和力來提高抗體的效應(yīng)功能外,Fc優(yōu)化工作也有助于改善抗體在體內(nèi)的循環(huán)。在體內(nèi)IgG的代謝調(diào)控受制于與新生兒受體（FcRn）的結(jié)合。FcRn結(jié)合在CH2,CH3的連接處，并呈現(xiàn)PH依賴性。IgG被細(xì)胞內(nèi)吞后穿梭進(jìn)溶酶體或者重新循環(huán)出細(xì)胞表面。在核內(nèi)體中，IgG在低PH (pH < 6.5)條件下與FcRn的結(jié)合，允許抗體和FcRn一起被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞表面。在低PH (pH < 6.5)條件下，與FcRn弱結(jié)合的抗體被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，最終被降解。在胞外生理環(huán)境中IgG與FcRn親和力降低，導(dǎo)致IgG被釋放，進(jìn)入再循環(huán)。PH依賴的結(jié)合通過低PH條件下His310, 435, 436質(zhì)子化來調(diào)節(jié)。質(zhì)子化產(chǎn)生了帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合與FcRn上帶負(fù)電荷的Glu117, Glu132, and Asp137。

點(diǎn)突變?cè)黾?/strong>Fc對(duì)FcRn的親和力

增加IgG1半衰期的總體的方法仍然是通過丙氨酸掃描突變。最終篩選到17個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變影響著IgG與Fcn的結(jié)合。在這17個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)中，當(dāng)Asn434 和 Glu380突變?yōu)锳la時(shí)，F(xiàn)c對(duì)FcRn的親和力顯著提高。Asn434Ala突變已經(jīng)被應(yīng)用于增強(qiáng)Fc與FcRn的結(jié)合，因此Asn434Ala突變加上Ser298Ala, Glu333Ala, 和Lys334Ala創(chuàng)造出AAAA突變來增加抗體與FcγR的結(jié)合，同時(shí)在一定程度上也改善了與FcRn的相互作用（表2）。其它的增加半衰期方法有通過噬菌體文庫隨機(jī)定向進(jìn)化篩選了出來。噬菌體的結(jié)合模擬核內(nèi)體環(huán)境在PH6.0的條件，洗脫條件在PH7.4條件，篩選到在生理?xiàng)l件下不與FcRn結(jié)合的突變體。通過不同的分析方法，證實(shí)有6種突變可以改善Fc與FcRn的結(jié)合，包括Glu294deletion/Thr307Pro/Asn434Tyr稱作C6A-66,以及Thr256Asn/Ala378Val/Ser383Asn/Asn434Ty稱作C6A-78。Asn434Tyr存在于眾多突變篩選結(jié)果中。這些收集到的突變之間的一點(diǎn)差異是對(duì)于FcγRIIIa結(jié)合力不同，因此在執(zhí)行延長半衰期的突變的時(shí)候存在保留或者敲出了ADCC作用的差異。在最近的研究中顯示C6A-66突變集中進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該突變對(duì)FcRn的結(jié)合提高趨于中間水平。但是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示有著最好的血清半衰期。對(duì)于突變集的研究類似于個(gè)別突變用于揭示Glu294刪除對(duì)功能的影響。該刪除突變也導(dǎo)致了Fc Asn297寡糖的唾液酸化。豐富的唾液酸化是體內(nèi)增加抗體半衰期必要的。因此，增加與FcRn結(jié)合的影響不是產(chǎn)生增加抗體的半衰期的唯一辦法。唾液酸化也可以調(diào)節(jié)抗體的半衰期。

表2.Fc修飾改善抗體半衰期

Ghetie et al.等人也開發(fā)了一個(gè)大的隨機(jī)突變庫，來篩選小鼠Fc突變?cè)黾悠溆郌cRn的結(jié)合。其中篩選到三個(gè)重要的Fc位點(diǎn)Thr252, Thr253, and Thr254。這三個(gè)位點(diǎn)是基于Fc與FcRn結(jié)合的近距點(diǎn)。通過噬菌體文庫篩選，篩選到Thr252Leu, Thr253Ser, 和 Thr254Phe突變集明顯的延長了抗體的半衰期。這種3點(diǎn)突變稱作LSF突變，該突變?cè)赑H6.0的條件下，對(duì)Fc與FcRn的結(jié)合速率沒有影響，卻降低了Fc從FcRn上解離的速率。這項(xiàng)研究結(jié)果表明，小鼠抗體252,254,256位氨基酸可以通過人工改造以增加半衰期。因此，在后面的研究中噬菌體文庫展示篩選人類IgG1中具有類似功能氨基酸位點(diǎn)突變252,254,256。在人類IgG1突變文庫中，Met252Tyr, Ser254Thr, 和 Thr256Glu是最為豐富的突變。這三點(diǎn)突變，通常稱作YTE突變,該突變導(dǎo)致Fc與FcRn的解離速率降低了10倍。整體上來講，YTE突變?cè)黾覨c與FcRn平衡常數(shù)近3倍。為了驗(yàn)證該突變是否在靈長類動(dòng)物體內(nèi)可以改變藥物動(dòng)力學(xué)，野生型IgG1和YTE突變抗體被輸注到食蟹猴體內(nèi)，與體外實(shí)驗(yàn)一致，YTE突變IgG1在食蟹猴體內(nèi)半衰期提升了近4倍。另外，在細(xì)支氣管流動(dòng)液中也檢測(cè)到了高濃度的YTE突變抗體。關(guān)于YTE突變的IgG1藥物藥物動(dòng)力學(xué)，雙盲實(shí)驗(yàn)，劑量爬坡試驗(yàn)正在進(jìn)行。在該研究中，YTE突變IgG1血清半衰期達(dá)到了80-112天。野生型IgG1的半衰期僅21天，YTE突變導(dǎo)致藥物半衰期在人體增加了4-5倍。在另外一項(xiàng)研究中，引入YTE突變的motavizumab其半衰期在靈長類動(dòng)物和人身上結(jié)果一致，血清半衰期的確增加了2-4倍。非常顯著地是YTE突變抗體治療的患者，240天后仍然可以檢測(cè)到輸注的抗體藥物。因此，YTE突變延長了藥物的作用時(shí)間，更有效地治療疾病。YTE突變的確延長了藥物半衰期，但是減弱了ADCC作用。由YTE突變引起的ADCC減弱可以通過增強(qiáng)ADCC作用的突變抵消掉，例如DLE突變。因此YTE突變應(yīng)該用于那些不需要ADCC作用的藥物抗體開發(fā)。

Zalevsky et al等人另一些關(guān)于改善血清半衰期的研究，采用合理的蛋白設(shè)計(jì)，引入Met428Leu 和Asn434Ser突變稱作LS突變，顯著的降低了IgG1 Fc對(duì)FcRn的解離速率，顯著提高在PH6.0條件下Fc與FcRn的親和力。與YTE突變不同的是LS突變不會(huì)明顯減少ADCC作用。在食蟹猴中，LS突變?cè)黾恿怂幬镅灏胨テ诮?倍。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在人類FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中,LS突變藥物的血清半衰期增加了3-4倍。在FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠建立的腫瘤移植模型中，LS突變的抗體藥物治療效果也有相應(yīng)的提高。在以上的兩種腫瘤免疫治療模型中LS突變的IgG1抑制腫瘤增殖效果明顯好于野生型IgG1藥物。自起初的LS突變，更多的突變研究增加了藥物在食蟹猴中的半衰期。在治療HIV感染的動(dòng)物模型中，LS突變能持續(xù)維持藥物抗病毒作用。LS突變的結(jié)果還有增加粘膜中抗體濃度和延長半衰期得作用。結(jié)合以上的優(yōu)點(diǎn)，在恒河猴感染HIV病毒的治療中,LS突變藥物治療效果明顯提升。臨床實(shí)驗(yàn)正在準(zhǔn)備引入LS突變的抗體藥物治療HIV感染。LS突變?cè)黾拥目笻IV病毒抗體藥物動(dòng)力學(xué)能否從恒河猴類比到人類還有待驗(yàn)證，是否延長在人類中的半衰期還有待評(píng)估。引入LS突變策略的優(yōu)點(diǎn)在于該突變?cè)谏項(xiàng)l件下完全消除了Fc與FcRn的結(jié)合，同時(shí)增加了低PH條件下二者的結(jié)合。

交叉亞型點(diǎn)突變?cè)黾?/strong>FcRn的結(jié)合

IgG1藥物Fc:FcRn關(guān)聯(lián)的半衰期為21天。不同于IgG1,IgG3在等位基因435位編碼的氨基酸為Arg，IgG1為His。IGHG3?17, IGHG3?18, and IGHG3?19等位基因是個(gè)例外，他們?cè)?35位編碼的氨基酸跟IgG1一樣為His。Arg435相對(duì)于His435抗體血清半衰期僅為7天。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)含有His435的IgG1對(duì)比Arg435的IgG3與FcRn的結(jié)合有明顯的優(yōu)勢(shì)。另外，含有Arg435的IgG3增加了生理?xiàng)l件下與FcRn結(jié)合，這就是導(dǎo)致IgG3被表達(dá)FcRn上皮細(xì)胞清除，阻礙IgG3在血清中再循環(huán)的原因。為了增加IgG3的半衰期，將435Arg突變?yōu)镠is，該突變?cè)黾恿薎gG3在低PH條件下與FcRn的結(jié)合。與親和力增加一致的是突變的IgG3血清半衰期和有效性都有所提高。因此，調(diào)節(jié)IgG3 PH敏感性是增強(qiáng)其血清半衰期的機(jī)制。

抗體Fc工程化設(shè)計(jì)消除其效應(yīng)功能

雖然Fc的優(yōu)化重點(diǎn)關(guān)注在獲得功能性改善，然而在某些特定情形下消除抗體Fc功能更有益。這些情形包括抗體用作（1）受體激動(dòng)劑，誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)，（2）受體拮抗劑，阻斷受體和配體的結(jié)合，抑制信號(hào)或（3）作為藥物載體遞送藥物到表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞（圖1C,D）。在以上的幾個(gè)例子中，F(xiàn)c與效應(yīng)細(xì)胞受體的結(jié)合，以及Fc與C1q的結(jié)合都是無意義的。因?yàn)槿绻３种鳩c功能將導(dǎo)致抗體藥物誤傷表達(dá)相應(yīng)受體的細(xì)胞，以及造成抗體偶聯(lián)藥物脫靶情況下誤傷重要的免疫細(xì)胞。接下來，將描述一些關(guān)于消除與FcγR，C1q結(jié)合的設(shè)計(jì)策略。

表3.Fc修飾沉默Fc的效應(yīng)功能

消除與FcγR的結(jié)合

點(diǎn)突變廢除與FcγR的結(jié)合

最早用于抑制移植排斥反應(yīng)的單抗藥物為OKT3。盡管對(duì)抗體進(jìn)行了人源化，但抗體誘導(dǎo)的炎癥因子釋放將造成細(xì)胞毒性。細(xì)胞因子的釋放歸因于OKT3結(jié)合與T細(xì)胞上的CD3,隨后Fc又與 FcγR結(jié)合。為了消除抗體Fc與T細(xì)胞FcγR結(jié)合造成的細(xì)胞因子釋放，需要對(duì)Fc進(jìn)行突變。一個(gè)點(diǎn)突變Leu235Glu足以敲除Fc與U937細(xì)胞表面受體的結(jié)合。此外，IgG1 Leu235Glu突變?cè)诮档虵cγR結(jié)合力100倍的同時(shí)也降低了T細(xì)胞激活和增殖。結(jié)合起初的Leu235Glu突變，Leu234Ala 和 Leu235Ala突變稱作LALA突變，消除了Fc與FcγRIIa的結(jié)合（表3和圖3A）隨后的研究表明，在IgG1和IgG4中LALA突變消除了與FcγRI, IIa, 和 IIIa的結(jié)合。LALA突變的確比Leu234Ala或Leu235Ala單點(diǎn)突變更為有效。一些研究表明Leu235Glu單點(diǎn)突變消除了Fc與FcγRI的結(jié)合。然而，另有一些研究表明，由于Fc與FcγRI的高親和力，仍然有突變體與FcγRI結(jié)合。類似的，Leu234Ala單點(diǎn)突變?nèi)杂型蛔凅w與FcγRI結(jié)合。234,235位單點(diǎn)突變和雙突變都減弱了PBMC介導(dǎo)的ADCC作用，幾乎消除了猴子中的ADCC作用。盡管如此，LALA突變?cè)谌祟愐呀?jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。包含LALA抗CD3抗體OKT3被用于腎臟移植造成的急性排斥反應(yīng)。包含LALA突變的IgG1引起的副反應(yīng)更小，逆轉(zhuǎn)了6-7例腎移植患者的排斥反應(yīng)。一個(gè)普遍的配對(duì)，除了LALA突變，Ser228Pro結(jié)合Leu235Glu,突變稱作SPLE突變或者PE突變，SPLE突變被引入了IgG4,這導(dǎo)致Fc與FcγR結(jié)合非常弱，對(duì)于IgG4來說，其與FcγR的結(jié)合本來就相對(duì)較弱，這可能要?dú)w因于IgG4中Phe234不同于IgG1中的Leu234。這種引入SPLE突變顯著降低了IgG4與FcγRI的結(jié)合，幾乎降低到了SPR的檢測(cè)極限，該突變并不影響抗體在大鼠體內(nèi)的半衰期。Ser228Pro突變還被認(rèn)為可以顯著改善IgG4的穩(wěn)定性。

LALA突變已經(jīng)為其他突變或者新的Leu235.修飾提供了基礎(chǔ)。在LALA突變的基礎(chǔ)上，Oganesyan et al等人突變了Leu234 和 Leu235，并額外突變了Pro331Ser，完全廢除了Fc與FcγRs的結(jié)合。Pro331Ser, Leu234Glu, and Leu235Phe三點(diǎn)突變?cè)诟淖兞伺cFcγRs的結(jié)合外，并沒有影響Fc的空間構(gòu)象。類似的Pro329Gly加上LALA突變抑制了鼠源IgG2a與FcγRI, II, 和III的結(jié)合。329位氨基酸的改變，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)氨基酸殘基涉及與FcγRIIIa Trp108 和 Trp131的相互作用。LALA-PG突變優(yōu)于單獨(dú)的LALA突變，該突變完全消除了小鼠和人Fc的效應(yīng)功能。而僅僅是LALA突變?nèi)匀槐Ａ袅耸笤碔gG2a抗體與FcγRIII的相互作用。LALA-PG突變的重要意義在于由于鼠源IgG2a與人類IgG1的相似性，該突變?cè)谛∈竽Ｐ蜕系慕Y(jié)果可以準(zhǔn)確類比轉(zhuǎn)移到人類身上。

LALA突變使最為廣泛的點(diǎn)突變用于干擾Fc與其受體的結(jié)合，然而，也存在其它點(diǎn)突變可以完全消除Fc與其受體的結(jié)合。Lund等人運(yùn)用丙氨酸掃描突變對(duì)IgG 32個(gè)位點(diǎn)突變，結(jié)果顯示Gly237和 Glu318是FcγRII結(jié)合的必需氨基酸。這兩個(gè)位點(diǎn)的缺失將造成吞噬作用的大幅減弱。其他丙氨酸掃描突變顯示存在9個(gè)決定性的氨基酸可以讓Fc喪失與FcγRI, IIa, IIb,和 IIIa結(jié)合的能力。尤其是Asp265Ala 和 Glu233Pro突變將影響Fc與FcγRI, IIa, IIb,和 IIIa結(jié)合能力下降＞80% 。Ala318, Ala237, Ala265,和 Pro233代表著一個(gè)突變集，可以用來做各種組合突變來消除Fc與其受體的結(jié)合。

圖3.沉默Fc功能的策略

Fc交叉亞型設(shè)計(jì)消除與FcγR的結(jié)合

為了沉默F(xiàn)c的效應(yīng)功能，不同亞型抗體Fc區(qū)域的大片段交換產(chǎn)生交叉Fc區(qū)域。這些設(shè)計(jì)結(jié)合不同亞型Fc作用不沖突的CH區(qū)域，旨在完全沉默F(xiàn)c的效應(yīng)功能。例如IgG2具有與FcγR弱結(jié)合但結(jié)合C1q的作用，但I(xiàn)gG4缺少與C1q結(jié)合但與FcγRs結(jié)合的作用。因此結(jié)合IgG2和IgG4 CH的特點(diǎn)構(gòu)建出缺乏與C1q,FcγR結(jié)合的交叉抗體。特別的，在IgG2/G4嵌合抗體中鉸鏈區(qū)和CH1來自于IgG2,CH2,CH3來自于IgG4。

運(yùn)用不同的方法達(dá)到同樣的目的，另一些學(xué)者類比不同亞型IgG的差異，并將突變引入IgG2產(chǎn)生完全消除與FcγR結(jié)合的作用。該方法的目的是向Fc引入天然的氨基酸以免產(chǎn)生免疫原性。一些研究者向交叉抗體的IgG2原始序列中引入保守突變產(chǎn)生His268Gln/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser突變體。該突變體稱作IgG2m4，缺乏與FcγR的結(jié)合。在恒河猴中，該突變抗體的半衰期與野生型IgG類似，這就意味著將IgG4的部分氨基酸一致進(jìn)IgG2并沒有引起過多的免疫反應(yīng)。

最近，Vafa結(jié)合25年前的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合眾多突變位點(diǎn)構(gòu)成稱作G2σ的突變（圖3B）。該結(jié)構(gòu)包含Val234Ala/Gly237Ala/Pro238Ser/His268Ala/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser突變。而這些突變位點(diǎn)中多數(shù)突變位點(diǎn)是為了建立沉默突變的，將其引入IgG2m4嵌合體。在直接比較了與IgG1, IgG2, IgG4, 和 IgG2m4結(jié)合FcγRI, IIa,和IIIa的相互作用，發(fā)現(xiàn)IgG2σ消除了與以上所述受體的結(jié)合。然而，體外實(shí)驗(yàn)顯示，IgG2m4和IgG2σ 缺少 PBMC效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC作用和幾乎微乎其微的ADCP租用殺傷乳腺癌細(xì)胞。鑒于IgG2σ廢除Fc作用的成功，將該突變引入IgG1和IgG4. IgG1σ(Leu234Ala/L235Ala/Gly237Ala/P238Ser/His268Ala/Ala330Ser/Pro331Ser), IgG2σ和擁有S228P/Phe234Ala/Leu235Ala突變的IgG4（稱作IgG4 PAA）在眾多物種中有類似的與FcγRs結(jié)合的作用。IgG1σ和 IgG2σ缺少與FcγRI和 III結(jié)合的作用。對(duì)于與Fc弱結(jié)合的FcγRIIa和IIb，IgG1σ和 IgG2σ即使在很高的濃度下都只有微弱地結(jié)合。IgG1σ和 IgG2σ相比與IgG4 PAA，與FcγRs的結(jié)合都相對(duì)較弱。IgG4 PAA在與FcγRs結(jié)合中也顯示了種屬特異性，而IgG1σ和 IgG2σ缺乏與人類，恒河猴，小鼠FcγRs結(jié)合的作用。因此IgG1σ和 IgG2σ是更為有效的敲出Fc功能的突變體。

Mimoto et al等人用表達(dá)FcγRIIb的B細(xì)胞上的FcγRIIb捕獲免疫復(fù)合物。因此，他們工程化Fc，篩選到與FcγRIIb結(jié)合增加200倍，與FcγRs親和力降低10倍左右的Fc結(jié)構(gòu)。該設(shè)計(jì)提高了Fc與FcγRIIb的親和力，改善了B細(xì)胞向T細(xì)胞遞呈抗原肽的能力。因?yàn)镕cγRII為抑制性受體，該突變可以用與需要改變激活與抑制比例改變的實(shí)例中。

廢除與C1q的結(jié)合，減少CDC作用

點(diǎn)突變廢除補(bǔ)體結(jié)合

誘導(dǎo)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)也是抗體藥引起不良反應(yīng)的一種形式。因此，消除與C1q的結(jié)合 --依賴于抗體補(bǔ)體激活反應(yīng)起始事件，已經(jīng)被作為一種優(yōu)化Fc的目標(biāo)。一種消除與FcγR結(jié)合的有益突變往往可以消除與C1q的結(jié)合。在以結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)的Fc突變篩選中，Ala330Leu突變被證實(shí)可以減弱與C1q的結(jié)合。就像之前所述的消除與FcγRIIb的結(jié)合。體外試驗(yàn)顯示，Ala330Leu突變降低了抗體通過CDC作用對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，可能要?dú)w因于Ala330Leu突變干擾了Fc與C1q的結(jié)合。然而并不是，所有引入330的氨基酸都可以改變Fc與C1q的結(jié)合，所以，330位點(diǎn)只有引入特異的氨基酸才能引起與C1q結(jié)合的減弱。需要注意的是Ala330Leu突變是系列突變DLE (Ser239Asp Ile332Glu Ala330Leu) 突變中的一個(gè)點(diǎn)，該突變?yōu)榱烁纳艶cγR介導(dǎo)的效應(yīng)功能。DLE優(yōu)化減弱了抗體介導(dǎo)的CDC作用，該效應(yīng)可以通過刪除Ala330Leu突變得到挽救。在一項(xiàng)實(shí)例中具有CDC作用的抗體會(huì)引起不良反應(yīng)，為此，引入DLE突變可以增加FcγR介導(dǎo)的效應(yīng)功能，消除注射位點(diǎn)的不良反應(yīng)。

其他通過丙氨酸掃描減少與C1q的結(jié)合被鑒定了出來。Asp270, Lys322,Pro329和Pro331都是IgG結(jié)合C1q的關(guān)鍵位點(diǎn)。在這些位點(diǎn)中，Asp270Ala 和Pro329Ala,顯得更加突出，該突變更有利于補(bǔ)體激活反應(yīng)缺陷和高血清C1q的弱結(jié)合。Leu234Glu/Leu235Phe/Pro331Ser三點(diǎn)突變的Fc缺少與FcγRs的結(jié)合，同時(shí)減弱了與C1q的結(jié)合。類似的，IgG2m4不光消除了與FcγR的結(jié)合，但同時(shí)也消除了也C1q的結(jié)合。Vafa et al.等人檢測(cè)了IgG2m4(His268Gln/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser) 和 IgG2σ (Val234Ala/Gly237Ala/Pro238Ser/His268Ala/Val309Leu/Ala330Ser/Pro331Ser)結(jié)構(gòu)的Rituxan抗體藥物的CDC活性。兩種形式的抗體都不能借助人類補(bǔ)體系統(tǒng)的CDC作用殺傷淋巴瘤細(xì)胞，這就意味著兩種形式的抗體都消除了補(bǔ)體介導(dǎo)的功能。IgG2σ Fc的晶體結(jié)構(gòu)顯示其開放的構(gòu)象意味著CH2結(jié)構(gòu)域之間的空間距離相當(dāng)大。此外，當(dāng)looP環(huán)中包含Leu328時(shí)，F(xiàn)c的構(gòu)象又回歸到野生IgG2的狀態(tài)。因此，可以推斷Fc空間構(gòu)想的改變產(chǎn)生于Asp270 和Pro329的重定向，最終導(dǎo)致了IgG2σ Fc與FcγR和C1q結(jié)合的減弱。

交叉亞型Fc廢除補(bǔ)體激活反應(yīng)

IgG亞型與補(bǔ)體相互作用的基礎(chǔ)知識(shí)很好的解釋了CDC效應(yīng)。例如IgG2擁有中等到低水平的CDC效應(yīng)。因此為了降低IgG3的CDC效應(yīng)，IgG2的CH2結(jié)構(gòu)域可以用來替代IgG3的CH2。類似的，由于IgG4 包含Ser331而缺乏CDC作用，因此，為了廢除IgG1 CDC作用，可以將IgG1進(jìn)行Pro331Ser突變。這些例子都很好的揭示了基礎(chǔ)科學(xué)研究如何運(yùn)用于抗體生物制品的設(shè)計(jì)。存在很多的交叉亞型突變用于敲出C1q的結(jié)合。（表3）

糖工程學(xué)廢除FcγR 和C1q結(jié)合

IgG的297位含有N連接的糖基化位點(diǎn)。（圖3C）。典型的N297為雙角的寡糖復(fù)合物。對(duì)該位點(diǎn)糖基化修飾的改造使其富含甘露糖殘基將的IgG1 Fc降低與C1q的結(jié)合，相應(yīng)的CDC作用減弱。抑制半乳糖糖基化或唾液酸修飾并不能沉默抗體Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能。當(dāng)寡糖中缺乏半乳糖或者唾液酸時(shí)，抗體功能正常，F(xiàn)c突變可以敲出與C1q和FcγRI結(jié)合，但同時(shí)也增加了Asn297寡糖中，半乳糖和唾液酸殘基的清除。Phe241Ala, Val264Ala, 和 Asp265Ala的點(diǎn)突變中也會(huì)引起半乳糖和唾液酸殘基修飾的增加。糖基化形式的改變是否是減弱與C1q結(jié)合，或者由無關(guān)的旁觀效應(yīng)引起，至今還不明確。在一項(xiàng)研究中，唾液酸化的Fc與C1q的結(jié)合減弱了4倍，這也就預(yù)示著高度唾液酸化會(huì)直接損壞CDC效應(yīng)。然而，高度唾液酸化修飾最終降低了糖基化修飾的復(fù)雜度，最終影響了與C1q的結(jié)合。

另一個(gè)普遍消除Fc效應(yīng)功能的方法是對(duì)297位糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變，例如用Ala,Glu,或Gly代替297位的Asn。移除糖基化位點(diǎn)顯著降低了IgG1與FcγRI 和 C1q的結(jié)合。在IgG3中Fc缺乏糖基化位點(diǎn)，含有糖基的Fc降低了與FcγRI 和 C1q的結(jié)合。在體外實(shí)驗(yàn)中，含有去糖基的IgG3失去了通過與FcγRIIIa結(jié)合介導(dǎo)的ADCC作用。但是，在小鼠中,移除Asn297的糖殘基并不能消除Fc與Fc受體的結(jié)合。另外，有人認(rèn)為可以通過突變Asn297來克服Fc與FcγRI親和力弱的趨勢(shì)。因此，在廣泛表達(dá)FcγRI的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中Asn297Gly突變并不足以消除Fc與FcγRI的結(jié)合。Lo et al等人結(jié)合Asn297Gly和Asp265Ala突變進(jìn)一步減弱與FcγR的結(jié)合。如上面關(guān)于減少與FcγRI 和 C1q的結(jié)合的突變，單獨(dú)或者結(jié)合突變可以進(jìn)一步降低與FcγRI 和 C1q的結(jié)合。例如Asn297Gly/Asp265Ala的結(jié)合突變幾乎敲出了Fc與FcγRI 和 C1q的結(jié)合。

關(guān)于去糖基化降低與FcγRI 和 C1q結(jié)合的機(jī)制還不明確。去糖基的Fc易于被蛋白酶降解，這就意味著去糖基的Fc與糖基化的Fc在結(jié)構(gòu)上是有差別的。核磁共振的研究結(jié)果也顯示出去糖基化的Fc結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。最有力的關(guān)于去糖基化影響Fc結(jié)構(gòu)的證據(jù)是不含N297寡糖小鼠Fc晶體結(jié)構(gòu)。CH3結(jié)構(gòu)域幾乎是一致的，但是去糖基化和糖基化的CH2相差10-14?。去糖基化的CH2結(jié)構(gòu)更加緊密，因此去糖基化的Fc空間構(gòu)象更加緊密，這種去糖基化引起的結(jié)構(gòu)緊密的現(xiàn)象不是小鼠獨(dú)有的。當(dāng)對(duì)去糖基化的人類IgG1和IgG4結(jié)晶時(shí)，結(jié)果顯示去糖基化的CH2結(jié)構(gòu)更加僵硬，CH2之間的距離靠近移動(dòng)了10-20?（圖3C）。去糖基化的Fc至少部分的介導(dǎo)擾動(dòng)了C’E loop?？傊?，去糖基化導(dǎo)致了Fc構(gòu)想更加緊密，起到了沉默F(xiàn)c效應(yīng)的功能。

結(jié)論

多種方法，包括噬菌體文庫，丙氨酸掃描，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)都可以用于對(duì)基于抗體的生物制品Fc進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化Fc的目的旨在調(diào)節(jié)其與Fc受體，C1q,FcRn的關(guān)系。這些關(guān)系可以通過點(diǎn)突變，插入，敲出氨基酸，修飾糖基化組成，甚至增補(bǔ)蛋白結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)。總體來說，加強(qiáng)或者減弱Fc與其結(jié)合搭檔的相互作用，體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都能很好的指導(dǎo)，預(yù)測(cè)，轉(zhuǎn)移到體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)中。對(duì)Fc特殊功能的優(yōu)化不僅僅是為了改善其在體內(nèi)的功能，也是更好的理解，評(píng)估Fc的功能，以及在疾病治療中的應(yīng)用。

原文來源：

Saunders KO.Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life.Front Immunol. 2019 Jun 7;10:1296.