嵌合抗原受體（CARs）T細胞進行過繼免疫治療是改善癌癥患者預后的一種非常有前景的方法。雖然CAR-T細胞血液系統(tǒng)惡性腫瘤很有效，但克服實體瘤依然困難重重，需要提高這種治療方法的療效。

目前，有幾種方法可以提高CAR-T細胞的抗腫瘤活性，包括靶向多種抗原；提高T細胞的增殖/持久性；增強腫瘤部位的歸巢以及使CAR-T細胞對免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）產(chǎn)生抵抗。

通過轉(zhuǎn)基因表達細胞因子或工程化的細胞因子受體來增強T細胞活化的信號已成為一種很有前途的策略，因為它不僅能提高CAR-T細胞的擴增和持久性，而且還能增強它們在免疫抑制性TME中的功能。

CARs由四個組成部分組成：細胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域，最常見的是單鏈可變片段（scFv）；結(jié)構(gòu)成分，如鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域；提供維持CAR-T細胞效應器功能的共刺激信號結(jié)構(gòu)域，以及CD3ζ 激活域。

生理性T細胞激活需要三種不同的信號來獲得效應器功能和形成免疫記憶。

信號1（激活）：T細胞受體（TCR）識別抗原后，通過CD3ζ介導的信號轉(zhuǎn)導。

信號2（共刺激）：來自CD28或其他分子的額外信號以增強信號1。

信號3由細胞因子介導，促進原始T細胞增殖分化，從而轉(zhuǎn)化為效應T細胞。 

第一代CAR僅通過CD3ζ提供信號1，第二代CARs也提供了信號2，通常通過CD28或4-1BB共刺激。盡管活化的CAR-T細胞能夠產(chǎn)生細胞因子，如IL-2，但反復暴露于腫瘤細胞后，細胞因子的產(chǎn)生會減少。另外，一些對T細胞效應器功能很重要的細胞因子，如IL-12和IL-15，要么表達水平低，要么根本不是由T細胞產(chǎn)生的。

由于這些局限性，研究人員開始著眼于進一步增強CAR-T細胞，通過組成性和誘導性表達細胞因子或者工程化細胞因子受體來增強信號3。

細胞因子的γ鏈共受體家族包括IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21，它們在T細胞分化，增殖和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著關鍵作用。這些細胞因子的受體包括共同的γ鏈(γc） 和一個各自單獨的受體鏈，但IL-2和IL-15共享IL-2Rβ。這些細胞因子受體下游信號激活STAT家族的成員。

IL-4和IL-9

到目前為止，IL-4和IL-9在過繼性細胞治療中的作用尚不清楚。IL-4雖然也有抗癌特性，但更多發(fā)揮的是免疫抑制作用。

IL-9最初被描述為一種參與Th2應答的T細胞生長因子，雖然很少有文獻評價IL-9在改善CAR-T細胞治療中的效用，但最近發(fā)現(xiàn)Th9/Tc9極化的人類CAR-T細胞與傳統(tǒng)的Th1/Tc1 CAR-T細胞相比具有更好的抗腫瘤活性。然而，關于IL-9在抗腫瘤反應中的作用存在相互矛盾的證據(jù)，需要進一步的工作來評估。

IL-2和IL-15

IL-2和IL-15促進免疫細胞增殖和抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄，但自然殺傷（NK）細胞和T細胞亞群對這兩種細胞因子的反應不同。高親和力IL-2受體由調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和活化的CD4、CD8+T細胞表達，而CD8+記憶T細胞和NK細胞對IL-2的反應程度較低。相反，CD8+記憶T細胞和NK細胞對IL-15的反應最為敏感，而Tregs對IL-15不反應。

與單獨治療相比，第1代CD19-CAR-T細胞通過結(jié)構(gòu)性表達IL-2能提高播散性淋巴瘤小鼠的無瘤生存率。然而，由于IL-2對Treg細胞的潛在擴增會阻礙抗腫瘤反應。此外，長期暴露于IL-2可促進激活誘導的細胞死亡（AICD），并且使T細胞向高細胞毒性的終末效應細胞分化，這些效應細胞雖然可有效殺死腫瘤細胞，但無法長久維持。

在靶向包括CD19、GPC-3、CLL-1、GD2和IL-13Rα2的CAR-T細胞中結(jié)構(gòu)性表達IL-15均顯著提高了CAR-T細胞的抗腫瘤活性。IL-15對記憶T細胞亞群如干細胞記憶T細胞（Tscm）的擴增或維持可能有助于增強CAR-T細胞作用的持久性。

第一代CD19-CAR-T細胞表達IL-15提高了其體內(nèi)抗腫瘤活性，并允許細胞在小鼠體內(nèi)存活長達110天。除了分泌性IL-15外，表達膜結(jié)合形式的IL-15是向CAR-T細胞提供激活信號的另一種方式。這種方法目前正在CD19-CAR-T細胞的1期試驗中進行評估。

除了CAR-T細胞外，CAR-natural killer T（NKT）細胞也被基因修飾以表達IL-15。IL15-NKT細胞維持了一個中樞記憶樣細胞群，這些細胞不太容易衰竭和凋亡，從而提高抗腫瘤活性。此外，IL-15保護CAR-NKT細胞免受缺氧TME的抑制。基于這些研究，目前正在評估共表達IL-15的GD2-CAR NKT細胞在神經(jīng)母細胞瘤患兒中的安全性和有效性。

IL-7

皮下注射IL-7可誘導循環(huán)中CD4和CD8+T細胞數(shù)量的劑量依賴性增加，而不會引起嚴重的不良事件。因此，IL-7的轉(zhuǎn)基因表達已被探索作為激活CAR-T細胞的替代方法。與表達IL-2或IL-15的CAR-T細胞相比，IL-7的結(jié)構(gòu)性表達提高了CD19-CAR-T細胞的抗腫瘤活性，這可能是持續(xù)的靶細胞殺傷和T細胞擴增的結(jié)果，但是這些細胞沒有表現(xiàn)出在表達IL-15的CD19-CAR-T細胞上觀察到的長期持久性。

IL-7同樣改善了CD20-和mesothelin-CAR T細胞，但這種作用需要C-C基序趨化因子配體19（CCL19）的共同表達。IL-7和CCL19的表達增加了CAR-T細胞、內(nèi)源性T細胞和樹突狀細胞的腫瘤內(nèi)浸潤，因而具有更好的抗腫瘤活性。目前，已有多項研究進入臨床階段，以評估IL-7和CCL19表達的CAR-T細胞對淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和實體瘤的安全性和有效性。

IL-21

與其他γc細胞因子激活STAT5相比，IL-21更傾向于激活STAT3，同時也通過PI3K和MAPK途徑介導增殖。第一代CD19-CAR-T細胞結(jié)構(gòu)性表達IL-21提高了播散性淋巴瘤小鼠的整體存活率。與表達IL-2、IL-7或IL-15的CAR-T細胞相比，表達IL-21的CAR-T細胞的總存活率提高最大，盡管這些細胞表達較低水平的Bcl-2、IFN-γ, TNF-α?？鼓[瘤活性的提高可能是由于維持低分化效應記憶T細胞（TEM）亞群，以及增強了長期持久性。目前，IL-21驅(qū)動的STAT3信號在CAR-T細胞免疫治療中的療效仍在探索中。

組成性活性細胞因子受體

增強T細胞活化信號3的另一種策略是通過工程化細胞因子受體的轉(zhuǎn)基因表達。例如， IL-7組成性活性受體（C7R）的表達可以克服由于負反饋機制引起的IL-7Rα下調(diào)，在不需要IL-7的情況下提供持續(xù)的STAT5信號。C7R介導增強的STAT5信號以抗原依賴的方式提高GD2-和EphA2-CAR-T細胞的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。評估表達C7R的GD2-CAR-T細胞的臨床試驗正在進行中。

表達IL-7Rα串聯(lián)IL-7是提供細胞內(nèi)IL-7信號的另一種方式。此外，通過表達嵌合的IL-7Rα串聯(lián)IL-17以及IL-2Rβ受體可以在CAR-T細胞中提供額外的信號，研究證明這些工程化的CAR-T細胞對TGF-β的抑制具有抗性。

嵌合細胞因子受體

嵌合細胞因子受體或開關受體可將一種細胞因子信號轉(zhuǎn)換為另一種細胞因子信號，目前正在積極探索如何劫持腫瘤或腫瘤相關細胞產(chǎn)生的免疫抑制細胞因子，以向CAR-T細胞提供增殖信號。

結(jié)合IL-4但激活IL-7信號通路的IL-4/IL-7開關受體可以使PSCA-CAR-T細胞在體外維持其細胞溶解和增殖能力，并提高體內(nèi)抗腫瘤活性。在原位乳腺癌模型中，IL-4/IL-7開關受體也提高了第二代MUC1-CAR-T細胞的抗腫瘤活性。重要的是，這些細胞能夠通過IL-4依賴性的方式增殖和消除腫瘤細胞，并對遠端的腫瘤再生作出反應。

此外，在MUC1或PSMA-CAR-T細胞中表達IL-4/IL-2開關受體，通過增加IL-4存在下的STAT5和ERK磷酸化，提高其細胞溶解活性和增殖能力。目前，表達IL-4/IL-2開關受體的CAR-T細胞治療頭頸部鱗狀細胞癌的1期臨床試驗正在進行中。

IL-4/IL-21開關受體被設計成將STAT6轉(zhuǎn)換成STAT3信號。這種開關受體在IL-4存在下提高了GPC3-CAR-T細胞的細胞溶解活性。很少有研究直接比較不同的細胞因子開關受體，然而，比較GPC3-CAR-T細胞中的IL-4/IL-7和IL-4/IL-21開關受體表明，在一種實體瘤模型中，IL-4/IL-21開關受體更為優(yōu)越。

IL-12細胞因子家族包括IL-12、IL-23、IL-27和IL-35，它們在先天性和適應性免疫應答中具有不同的作用，其中IL-12和IL-23具有促炎作用，IL-27具有促炎和抗炎作用，IL-35具有抗炎作用。由于IL-27和IL-35的主要抗炎作用，在過繼性細胞治療中，只有IL-12和IL-23有所研究。

IL-12

IL-12作為單藥，在臨床前模型中，系統(tǒng)給藥產(chǎn)生了強大的抗腫瘤活性。然而，重組人IL-12的臨床試驗療效有限，并且收到毒性的限制。盡管如此，表達IL-12的CAR-T細胞的仍在積極探索中。

MUC16ecto-CAR-T細胞表達IL-12增強了IFN-γ的表達和持久性，提高了原位異種移植模型的存活率。研究表明，CAR-T細胞通過自分泌IL-12信號增強效應器功能，與腫瘤相關免疫細胞相互作用，耗竭免疫抑制髓系細胞，阻斷腫瘤的PD-L1抑制。表達IL-12的MUC16ecto-CAR-T細胞的臨床研究正在進行中。

此外，工程化T細胞組成性表達IL-12可能促進T細胞功能障礙，并且在臨床前模型中觀察到毒性，因此設計了受活化T細胞核因子（NFAT）啟動子控制的IL-12表達。NFAT啟動子將IL-12表達與T細胞活化聯(lián)系起來，在不降低抗腫瘤活性的情況下降低全身毒性。NFAT誘導的IL-12表達的CAR-T細胞在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的I/II期臨床試驗正在進行中。

IL-23

雖然很少有研究將IL-23與細胞治療相結(jié)合，但最近的研究表明，這可能是改善實體瘤中CAR-T細胞功能的一種選擇。IL-23誘導STAT3激活，而CAR-T細胞中的STAT3信號與慢性淋巴細胞白血病患者的響應相關。目前，STAT3信號的調(diào)節(jié)已用于改善其他臨床前模型中的CAR-T細胞。

IL-1超家族細胞因子包括IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-1Ra、IL-18、IL-37、IL-36Ra、IL-36α、IL-36β、IL-36γ和IL-38，它們在先天性和適應性免疫中起著重要作用。但在臨床前和臨床試驗中，這些細胞因子中只有一部分被認為為能夠誘導抗腫瘤免疫反應。

IL-18

IL-18是由巨噬細胞、樹突狀細胞、上皮細胞以及其他細胞類型產(chǎn)生的一種促炎癥細胞因子，與NK細胞和抗原相關T細胞上表達的由IL-18Rα和IL-18Rβ組成的異二聚體受體相互作用。IL-18通過MyD88和NF-kB發(fā)出信號，并已被證明具有促腫瘤功能，如促進血管生成、轉(zhuǎn)移和增殖，但由于其在Th1反應中的協(xié)同作用，被認為在更大程度上具有抗腫瘤活性。

將人類和小鼠的CAR-T細胞中表達IL-18，可以改善CAR/TCR介導的增殖、細胞因子的產(chǎn)生和抗腫瘤活性。一項研究表明在CD4-CAR-T細胞中表達IL-18促進了CD8-CAR-T細胞的擴增。

IL-36

IL-36α, IL-36β, 和IL-36γ 是新發(fā)現(xiàn)的IL-1超家族成員，在臨床前模型中顯示出強大的抗腫瘤活性。這些細胞因子共享一個由IL-36R和IL-1RAcP組成的異二聚體受體，通過MyD88和NF-kB激活下游信號。研究表明，工程化CAR-T細胞表達IL-36γ 與未修飾的CAR-T細胞相比，提高了增殖和持久性，從而提高了抗腫瘤活性。

研究表明，轉(zhuǎn)基因細胞因子不僅能增強CAR-T細胞的抗腫瘤活性，而且能調(diào)節(jié)TME內(nèi)的其他細胞，并能誘導或增強內(nèi)源性腫瘤特異性免疫反應。然而，增強CAR-T細胞功能的繼發(fā)性基因修飾可能加重CRS，因此改善CAR-T細胞擴增的方法必須與劑量限制性毒性的風險相權(quán)衡。

到目前為止，大多數(shù)研究只探討了單個細胞因子的組成性表達。在CAR-T細胞活化的不同階段，開發(fā)能使CAR-T細胞表達一系列細胞因子的方法，不僅可以提高療效，而且可以提高安全性。隨著這些方法的發(fā)展，相信未來細胞因子將為CAR-T細胞克服實體瘤提供更加強大的助力。

參考文獻：

1. Engineered Cytokine Signaling to Improve CAR T CellEffector Function. Front Immunol. 2021; 12: 684642.