乳腺癌是全世界女性與癌癥相關(guān)的死亡的主要原因。作為異質(zhì)性疾病，乳腺癌已被分類(lèi)為幾種分子亞型，包括HER2陽(yáng)性乳腺癌，其定義為具有擴(kuò)增和/或過(guò)表達(dá)的HER2（或erbB2）基因的亞型。在大約20–25％的乳腺癌中觀察到HER2的擴(kuò)增/過(guò)度表達(dá)，并且與乳腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。赫賽汀是一種人源化的抗HER2單克隆抗體，是針對(duì)早期和轉(zhuǎn)移性HER2陽(yáng)性乳腺癌的有效HER2靶向療法。它顯著提高了患有HER2陽(yáng)性腫瘤的乳腺癌患者的生存率。但是，并非所有HER2陽(yáng)性乳腺癌都對(duì)基于赫賽汀的治療方案有反應(yīng)。多數(shù)獲得初始反應(yīng)的患者會(huì)在一年之內(nèi)成為耐藥患者?？顾幮阅[瘤可能會(huì)復(fù)發(fā)并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，約占癌癥死亡人數(shù)的90％。許多HER2陽(yáng)性晚期乳腺癌的患者最終會(huì)發(fā)展為腦轉(zhuǎn)移。迄今為止，缺乏可預(yù)測(cè)的赫賽汀反應(yīng)的有效生物標(biāo)志物。因此，深入了解HER2陽(yáng)性乳腺癌中赫賽汀耐藥性形成的機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)新的有效靶點(diǎn)，進(jìn)而開(kāi)發(fā)更有效地靶向治療，具有重要的臨床意義。

2021年5月11日廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院鄭國(guó)沛、賀智敏及易斯安那州立大學(xué)Liu Bolin等科學(xué)家聯(lián)合在《NATURE COMMUNICATIONS》（2019年影響因子12.121）上在線(xiàn)發(fā)表了題為“Disruption of FOXO3a-miRNA feedback inhibition of IGF2/IGF-1R/IRS1 signaling confers Herceptin resistance in HER2-positive breast cancer.”的文章，揭示了赫賽汀耐藥乳腺癌中IGF2/IGF-1R/IRS1信號(hào)激活的關(guān)鍵機(jī)制。

該研究中，鄭國(guó)沛教授團(tuán)隊(duì)利用來(lái)自于HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株SKBR3和BT474，及其誘導(dǎo)的赫賽汀耐藥的SKBR3-pool2 (pool2) 和 BT474-HR20 (HR20)細(xì)胞株，探索IGF-1R信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。在pool2和HR20細(xì)胞中，IRS1和磷酸化的IGF-1R (p-IGF1R)、Akt(p-Akt^(T308)和p-Akt^(S473)、S6K (p-S6K)和FOXO3a (p-FOXO3a)水平分別高于SKBR3和BT474細(xì)胞。赫賽汀耐藥細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中IGF2蛋白水平明顯高于敏感細(xì)胞。通過(guò)特異性shRNA或CRISPR-Cas9基因編輯下調(diào)IRS1，顯著地使耐藥細(xì)胞對(duì)赫賽汀治療重新敏感。IGF-1R抑制劑、Akt 抑制劑和mTOR抑制劑逆轉(zhuǎn)了pool2和HR20細(xì)胞的抗性表型。過(guò)表達(dá)IRS1聯(lián)合高劑量(80 ng/ml) rhIGF2可將SKBR3和BT474轉(zhuǎn)化為赫賽汀耐藥細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，IGF2/IGF-1R/IRS1信號(hào)維持赫賽汀耐藥表型。

圖1. IGF2/IGF-1R/IRS1/Akt/mTOR信號(hào)通路參與了her2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)赫賽汀的耐藥

IGF2在高劑量(80 ng/ml)誘導(dǎo)IGF-1R/Akt/mTOR信號(hào)通路負(fù)反饋抑制。過(guò)表達(dá)IRS1并沒(méi)有改變r(jià)hIGF2對(duì)p-IGF-1R水平的影響，但挽救了rhIGF2 (80ng /ml)誘導(dǎo)的p-Akt^(T308)、p-Akt^(S473)、p-S6K和p-FOXO3a的減少。通過(guò)特異性shRNA或CRISPR-Cas9基因編輯下調(diào)FOXO3a表達(dá)不僅提高了IRS1的基礎(chǔ)水平，還消除了rhIGF2 (80 ng/ml)誘導(dǎo)的IRS1下調(diào)。FOXO3a驅(qū)動(dòng)IRS1表達(dá)的可能是IGF2 (80ng /ml)誘導(dǎo)的負(fù)反饋抑制HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞信號(hào)通路的重要機(jī)制。

圖2.FOXO3a和IRS1在her2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控igf2觸發(fā)的IGF-1R/Akt/mTOR信號(hào)的負(fù)反饋抑制

熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明miR-128-3p和miR-30a-5p直接靶向IRS1。通過(guò)特定的shRNA或CRISPR-Cas9基因編輯下調(diào)FOXO3a不僅降低了miR-128-3p和miR-30a-5p的基礎(chǔ)水平，而且取消了rhIGF2 (80ng /ml)誘導(dǎo)的miRNA的上調(diào)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)隨后的qPCR分析表明，F(xiàn)OXO3a調(diào)控miR-128-3p、miR-30a-5p。上述結(jié)果顯示了FOXO3a轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-128-3p和miR-30a-5p在HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中控制IRS1表達(dá)的關(guān)鍵作用。

圖3. FOXO3a控制miRNAs影響IRS1表達(dá)和負(fù)反饋抑制IGF-1R/Akt/mTOR信號(hào)通路

接下來(lái)，作者試圖探索IGF2觸發(fā)IGF-1R/Akt/mTOR信號(hào)負(fù)反饋抑制過(guò)程中改變p-FOXO3a水平的潛在機(jī)制?；净钚跃S持PPP3CB（絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2B的一個(gè)亞基）的表達(dá)，以限制FOXO3a磷酸化（p-FOXO3a），誘導(dǎo)靶向IGF2和IRS1的miRNA。

圖4.PPP3CB介導(dǎo)的p-FOXO3a水平下降改變了反饋調(diào)控

進(jìn)一步明確FOXO3a-miRNA軸的失調(diào)是導(dǎo)致赫賽汀耐藥的關(guān)鍵性影響因素，作者使用分子抑制劑分析這些數(shù)據(jù)確立了FOXO3a通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控特定miRNA來(lái)控制IGF2和IRS1表達(dá)的重要作用，從而改變HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中赫賽汀的敏感性。

圖5.FOXO3a-miRNAs軸失調(diào)導(dǎo)致赫賽汀耐藥

ChIP-qPCR分析顯示， p-STAT6在PPP3CB啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)富集。Co-IP檢測(cè)證實(shí)了p-STAT6和HDAC1在赫賽汀耐藥細(xì)胞中相互作用。而Src抑制劑SU6656降低了p-STAT6。在赫賽汀耐藥乳腺癌細(xì)胞中Src激酶的激活(由p-Src的增加證明)可能促進(jìn)STAT6的磷酸化從而增強(qiáng)其與HDAC1的相互作用，隨后p-STAT6/HDAC1復(fù)合物協(xié)同抑制了赫賽汀耐藥乳腺癌細(xì)胞中PPP3CB的表達(dá)。

圖6.src介導(dǎo)的STAT6/HDAC1信號(hào)通路降低了赫賽汀耐藥細(xì)胞中PPP3CB的表達(dá)

作者在體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了IRS1對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌赫賽汀體內(nèi)療效中的作用。赫賽汀聯(lián)合特異性下調(diào)IRS1導(dǎo)致了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的持續(xù)顯著抑制。此外，ELISA分析結(jié)果表明，赫賽汀反應(yīng)差患者血清IGF2水平明顯高于反應(yīng)好患者血清IGF2水平。

圖7. PPP3CB/FOXO3a/IRS1信號(hào)通路導(dǎo)致體內(nèi)對(duì)赫賽汀反應(yīng)不佳

1. 在赫賽汀敏感細(xì)胞中，F(xiàn)OXO3a調(diào)節(jié)特定的miRNA，以控制IGF2和IRS1的表達(dá)，并保留基本的IGF2 / IGF-1R / IRS1信號(hào)傳導(dǎo)。基本活性維持PPP3CB的表達(dá)，以限制p-FOXO3a，誘導(dǎo)靶向IGF2和IRS1的miRNA。

2.在赫賽汀抗性細(xì)胞中，由于PPP3CB的轉(zhuǎn)錄抑制，p-FOXO3a水平升高，從而破壞了FOXO3a和miRNA形成的負(fù)反饋抑制環(huán)，從而上調(diào)了IGF2和IRS1。

3.對(duì)含赫賽汀治療方案反應(yīng)較差的乳腺癌患者的腫瘤中血液中的IGF2和IRS1顯著增加。

該研究中使用慢病毒介導(dǎo)的 CRISPR-Cas9 技術(shù)產(chǎn)生乳腺癌細(xì)胞中的基因缺失由吉?jiǎng)P基因提供，實(shí)現(xiàn)高效特異的基因敲除效率。

廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所鄭國(guó)沛，賀智敏及易斯安那州立大學(xué)Liu Bolin為本文通訊作者。鄭國(guó)沛研究員為最后通訊作者。