1）對mRNA前體hnRNA的剪接和加工；例如5’-端加帽、3’-端polyA尾、RNA修飾、RNA剪接。

2）mRNA由細胞核轉(zhuǎn)至細胞質(zhì)的過程及定位；

3）mRNA的穩(wěn)定性、降解、翻譯過程等多個環(huán)節(jié)進行的調(diào)控；

4）RNA編輯和RNA干擾等現(xiàn)象也屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

m⁶A甲基化修飾是指腺嘌呤的6號碳原子連接的氨基基團中的一個氫被甲基基團取代，在m⁶A甲基化過程中涉及的這3類重要的酶：

m⁶A具有調(diào)控可變剪切、調(diào)控mRNA出核轉(zhuǎn)運、調(diào)控mRNA的選擇性翻譯和翻譯速率、相分離以及與RNA的穩(wěn)定性有關(guān)等功能。

m⁶A作為最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾，介導(dǎo)了超過80%的RNA甲基化。其調(diào)控機制與生物學功能涉及各個領(lǐng)域：

醫(yī)學：

1）癌癥：肺癌、肝癌、等，研究的主要內(nèi)容包括m⁶A修飾如何影響腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等；

2）其它類疾病：心血管疾病，神經(jīng)性疾病，代謝類疾病等；

3）胚胎發(fā)育等。

農(nóng)學：

研究的物種有果蠅，斑馬魚，豬；擬南芥、玉米，水稻，番茄等。

實驗樣本：

細胞、組織、提取后的總 RNA（限定有參基因組物種）。

實驗分組：

細胞模型：實驗組VS對照組，建議3:3

組織模型：正常組VS疾病組，建議5:5

組內(nèi)對照：IP組VS input組*

注*：input組主要用于比較鑒定IP組的抗體特異性結(jié)合，是必備的組分

測序平臺：NovaSeq

關(guān)鍵分析內(nèi)容：

m⁶A的基本特征

特征一. Peak在基因元件的分布

特征二. reads在基因元件的分布

特征三. Peak關(guān)聯(lián)基因的特征

· 樣本類型：細胞、組織、total RNA

· 樣本要求：

?人、大鼠、小鼠

常規(guī)MeRIP-seq：Dnase消化后RNA總量≥25μg，濃度≥100 ng/μg，RIN≥8；

?非人非鼠物種

Dnase消化后RNA總量≥150μg，濃度≥100 ng/μg，RIN≥8。

注：

1）人、小鼠和大鼠可同時檢測mRNA和lncRNA上的m⁶A修飾，非人非鼠物種（人、小鼠、大鼠以外的物種）只能檢測mRNA上的m⁶A修飾；

2）盡量提供RNA樣本；

3）如需公司進行RNA提取，請根據(jù)樣本特性估算樣本量，最終獲得的RNA質(zhì)量和總量以質(zhì)檢結(jié)果為準；

4）活體取樣，剔除結(jié)締組織以及其它非研究組織，用預(yù)冷的PBS漂洗，去除血液和雜質(zhì)。體積較大的組織需切割成綠豆大小的小塊。將組織放入事先標記好樣本信息的RNAase-free管中（管子速凍后無法做標記），立即液氮速凍2min，-80℃保存。

測序數(shù)據(jù)下機之后，我們就可以獲得原始測序序列(Sequenced Reads)，在有相關(guān)物種參考序列或參考基因組的情況下，我們通過如下標準流程進行生物信息分析：

MeRIP-qPCR：利用m6A抗體在富集到帶甲基化修飾的RNA后，下一步使用qPCR直接對富集到的RNA進行定量的一種技術(shù)。建議結(jié)合基因表達RT-qPCR 、WB等驗證手段一起進行試驗結(jié)果驗證。

典型的m⁶A研究的法則：

1） m⁶A測序前的預(yù)實驗，檢測RNA的m⁶A水平是否發(fā)生差異等；

2） m⁶A測序及轉(zhuǎn)錄組學挖掘差異基因；

3） 后期功能驗證。

1、針對全基因組范圍內(nèi)檢測m⁶A的存在；

2、m⁶A的檢測結(jié)果檢測到基因水平；

3、能夠明確每個基因的修飾水平，進行組與組之間比較；

4、檢測平臺為測序儀，儀器限制低，通用性高，重復(fù)性好；

5、結(jié)果可以和其他組學聯(lián)合分析，從多維度講述機制機理故事；

6、實驗操作簡單，入門容易。