測序質(zhì)控是我們拿到測序數(shù)據(jù)后第一時間要做的事情。

高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)對我們后續(xù)工作的質(zhì)量提供了保證。

fastqc提供可視化的質(zhì)控報告，通過三種顏色來標注測序質(zhì)量，綠色：完全正常，橙色：略有異常，紅色：異常

原則上，全部為綠色的報告代表測序質(zhì)量合格。然而事實上，實際產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)報告不會是全部綠色的，那么報告為什么會異常？何種異常我們需要重新測序，何種異常我們可以忽略不計呢？

在本文中，我們將質(zhì)控報告分段式依次進行解說，并標記關(guān)注程度，以及出現(xiàn)異常后的處理方法。

1)Per base sequence quality (很重要，重點關(guān)注！)

橫軸為read位置，縱軸是質(zhì)量值quality，質(zhì)量值越高，代表質(zhì)量越好

堿基質(zhì)量很好 (綠色)、堿基質(zhì)量一般(黃色) 以及堿基質(zhì)量差 (紅色)。

像這樣的圖，基本都在綠色區(qū)域，代表測序質(zhì)量很好

像下面這樣的圖，很快就進入紅色區(qū)域，代表測序質(zhì)量不好。建議重新測序，或者將低質(zhì)量序列切除后再繼續(xù)后續(xù)分析。

2) Per Tile sequence quality (不重要，可略過)

一般是這樣藍汪汪的一片，代表比較好。

3）Per sequence quality score （一般重要）

橫軸為測序質(zhì)量值，縱軸為 reads 數(shù)量；峰值越靠右，代表越好；如出現(xiàn)雙峰，或者峰值比較靠左，代表有異常，即測序中存在一定比例的低質(zhì)量位點。

4）Per Base Sequence Content （不重要，可略過）

這步是fastqc報告中經(jīng)常黃色甚至紅色報錯的部分，但實際報警不一定代表質(zhì)量不合格，需要分別對待。

這部分示意圖橫坐標是指堿基位置，縱坐標是該位置上ATCG堿基的比例。理論上，一個完美的文庫，其ATCG是應(yīng)該隨機存在的，即圖中的四條顏色的線應(yīng)為互相接近的四條平行線。然而實際上的質(zhì)控結(jié)果經(jīng)常如上圖所示，存在ATCG的波動。

如整條片段存在波動，這種情況一般出現(xiàn)在擴增子測序中，屬于正常情況（雖然報告中標黃或紅色），這是因為擴增的片段，如16S本身就具有一定的GC特點，并非完全隨機。

如開頭片段出現(xiàn)波動，這種情況一般出現(xiàn)在基于轉(zhuǎn)座酶或內(nèi)切酶的建庫方法的測序數(shù)據(jù)中。這是因為酶的識別區(qū)域存在一定的偏好性，所以開頭10bp左右并非ATCG隨機出現(xiàn)。這種情況屬于正常，即使是有黃色或紅色報錯也一般無需額外處理。

如結(jié)尾片段出現(xiàn)波動，可能是接頭沒有去除干凈，建議采用生信的方法去除這部分序列。

5）Per Sequence GC Content （很重要）

這一步雖然統(tǒng)計的只是每條序列的GC含量的分布，但我們可以用它來評估樣本中的污染情況。

對于一個正常的菌基因組文庫，其GC含量分布應(yīng)該接近正態(tài)分布，在圖中應(yīng)該是個單峰。但在實際的測序過程中，常常會發(fā)現(xiàn)雙峰的情況，則說明文庫有污染（有雜菌，或者核酸污染，或者文庫污染）。

因此，如此部分報錯，需要高度警惕，回查可能的原因。如為污染，需重新提取核酸后建庫測序。

6）Perbase N Content（不重要）

每個位置上N的比例。

不重要。一般不會報錯，或報錯影響不大。

7）Sequence Length Distribution （不重要）

read長度分布。對于下機原始數(shù)據(jù)就應(yīng)該是上機時設(shè)置的read 長度。此部分一般不會報錯，或報錯影響不大。

8）Sequence Duplication Level （一般重要）

測序read中重復(fù)序列出現(xiàn)的情況。

理論上，一個完美的文庫應(yīng)該都是unique read或duplicate很少。但，實際上考慮到二代建庫過程中PCR步驟的存在，文庫中存在duplication 序列無法避免。且這部分數(shù)據(jù)可后續(xù)通過生信的方法很容易去除。

因此，即使報錯，對結(jié)果影響不大。

因此此部分評估結(jié)果，可以作為對文庫質(zhì)量控制的指標，但不用過于糾結(jié)要求必須通過。

9）Overrepresented sequences（一般重要）

顯示超過0.1% 總read數(shù)的序列。對于基因組測序和宏基因組測序，正常文庫內(nèi)都不應(yīng)該有一條序列這么高的豐度，如出現(xiàn)則說明可能有異常。

對于擴增子測序，出現(xiàn)結(jié)果則屬于正常。

10）Adaptor content（一般重要）

接頭含量。正常的測序結(jié)果接頭應(yīng)該都被自動去除了，如此步還存在一定的接頭序列，則說明未去除干凈，可采用生物信息方法重新去除。

簡單的小結(jié)一下，雖然fastqc報告很長，對多個環(huán)節(jié)開展了質(zhì)控，但其實我們并不需要追求完美，只要重點關(guān)注

Basic Statistics （基本信息統(tǒng)計）、Per base sequence quality（堿基質(zhì)控圖）、Sequence GC Content（GC分布圖，用于評估污染）這三個部分。

此外，再一般關(guān)注下Sequence Duplication Level、Overrepresented sequences等4個部分就足夠了。

其余的幾個環(huán)節(jié)，如有報錯，具體情況具體分析，但個人認為就無需強求必須全部通過了呢。

以上是筆者對于細菌基因組測序、宏基因組測序數(shù)據(jù)結(jié)果質(zhì)量控制報告解讀的解讀。您怎么看？歡迎討論點評～