自噬（autophagy）相信大家都不陌生了，從2005年開(kāi)始，關(guān)于自噬的研究越來(lái)越多，涉及的疾病和領(lǐng)域也越來(lái)越多。這兩年雖然熱度不及之前，但國(guó)自然自噬相關(guān)研究的中標(biāo)數(shù)量還是呈增長(zhǎng)趨勢(shì)的。毫不夸張的說(shuō)，只要標(biāo)書(shū)寫(xiě)了自噬，中標(biāo)的概率就增加了幾分，只要你的信號(hào)通路拉上了自噬，文章就可以再往上攀一攀。

當(dāng)時(shí)小優(yōu)就很羨慕隔壁實(shí)驗(yàn)室的，做自噬做的滾瓜爛熟，文章拿到手軟，一篇autophagy（雜志）可以讓你獎(jiǎng)學(xué)金拉滿。下面這個(gè)前輩也是憑借闡述細(xì)胞自噬的機(jī)制拿到了諾貝爾“獎(jiǎng)學(xué)金”。

這時(shí)隔壁熱心的師兄告訴小優(yōu)，想要觀察自噬有沒(méi)有參與，最簡(jiǎn)單的就是做下LC3的WB。WB這個(gè)小優(yōu)可擅長(zhǎng)了，三下五除二，就借（騙）到了隔壁實(shí)驗(yàn)室的LC3抗體。

還是先查查L(zhǎng)C3再做吧，LC3是一種蛋白輕鏈3，是自噬過(guò)程的標(biāo)志物。它的功能主要參與了自噬小體的形成， LC3前體分子被ATG4B剪去C端的5肽，裂解形成胞質(zhì)形式LC3-I。然后被APG7L / ATG7激活，轉(zhuǎn)移至ATG3并偶聯(lián)脂酰乙醇胺（PE）以形成膜結(jié)合形式LC3-II它可以附著到自噬體(autophagosome)的膜上，是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白。怪不得文獻(xiàn)中涉及自噬的都會(huì)做LC3-I和LC3-II。

另外，LC3也在線粒體自噬中也發(fā)揮作用，通過(guò)消除線粒體至基本水平來(lái)滿足細(xì)胞能量需求并防止過(guò)量的ROS產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)線粒體的數(shù)量和質(zhì)量。線粒體的自噬主要是通過(guò)PINK啟動(dòng)的，PINK 蛋白在健康狀態(tài)下通過(guò) PARL 的作用持續(xù)降解，而在線粒體損傷時(shí), PARL受到抑制，PINK 穩(wěn)定并招募 E3 連接酶 Parkin，以啟動(dòng)自噬。

好啦，了解的差不多了，可以動(dòng)手做了。這時(shí)隔壁熱心的師兄又提醒我，你這個(gè)樣本表達(dá)怎么樣??？對(duì)哦，完全忘了這茬事了。如果我做的樣本不表達(dá)或者表達(dá)很低，我也做不出來(lái)呀。

沒(méi)辦法，再去查查資料。在哺乳動(dòng)物中，存在 4 種LC3 同工型（LC3A、LC3B、 LC3B2和 LC3C），在不同的組織細(xì)胞中表達(dá)會(huì)有差異。目前主要研究的是LC3A和LC3B，LC3C在許多細(xì)胞中表達(dá)量很低，研究的也較少。LC3A主要在大腦中表達(dá)，其他組織的表達(dá)較低。LC3B在腦、內(nèi)分泌組織等有較高的表達(dá)，在肝臟、結(jié)腸、心肌、脾臟等基本不表達(dá)。LC3B2許多組織中都有較高的表達(dá)，在骨骼肌中基本不表達(dá)。

沒(méi)辦法，只能再去求助隔壁的師兄。師兄說(shuō)LC3分子量比較小，只有16KD，在電泳的時(shí)候需要使用12%-15%的膠，避免跑過(guò)。轉(zhuǎn)膜的時(shí)候需要使用0.22um的膜，縮短轉(zhuǎn)膜的時(shí)間，40min即可。切莫使用0.45um的膜，否則量相對(duì)少的LC3I更不容易顯出來(lái)。

經(jīng)過(guò)師兄的指導(dǎo)，小優(yōu)終于做出了條帶。咦，我這個(gè)為什么是一條帶？別人文獻(xiàn)中明明都是兩條帶的，而且可以統(tǒng)計(jì)自噬的水平，我這個(gè)怎么辦呢？

師兄不厭其煩的給我解釋到：在自噬過(guò)程中，LC3-I逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)化的LC3-II，當(dāng)自噬的程度比較高時(shí)，LC3-I的量是較低的。當(dāng)LC3-I和LC3-II總量恒定時(shí)，LC3-II/LC3-I用來(lái)表示自噬的水平。其次，與LC3-II相比，LC3-I對(duì)反復(fù)凍融更加敏感，更容易降解，因此一般需要用新鮮制備樣品上樣。這點(diǎn)倒是有可能，之前制好的樣本經(jīng)過(guò)幾次優(yōu)化和反復(fù)凍融，有可能造成LC3-I檢測(cè)不到。

師兄說(shuō)完轉(zhuǎn)身從抽屜拿出了一本厚厚的本子，封面的字已經(jīng)看不清了，隱約有一個(gè)“抗”字。翻到其中一頁(yè)，給我講到：目前的LC3抗體所檢測(cè)的抗原表位都位于LC3的N端，由于PE基團(tuán)結(jié)合可能導(dǎo)致N端區(qū)域的構(gòu)象變化，使得抗體對(duì)LC3-II的親和性更高。以CST抗體為例，LC3B的貨號(hào)有單克隆抗體# 3868和多克隆抗體#2775。3868特異性高，2775靈敏度高，2775更容易識(shí)別LC3-I。

師兄又抽出夾在本子中的一張卡片給我看：

在這里，小優(yōu)以血的經(jīng)歷告訴大家，沒(méi)事別碰自噬。哦不，做之前一定要多查查自己樣本的表達(dá)情況和自噬情況。如果不確定的話，可以簡(jiǎn)單做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，用氯喹過(guò)夜處理 (50uM) Hela細(xì)胞，這樣可以幫助大家判斷到底是什么問(wèn)題導(dǎo)致WB或者熒光不出結(jié)果。這時(shí)，我才明白老板的用心良苦啊。