眾所周知，免疫細胞的協(xié)調(diào)在許多重要的組織功能中都起到關(guān)鍵作用，例如傷口愈合，組織穩(wěn)態(tài)或病毒清除等等[1]。

在抗癌反應(yīng)中它們也同樣有著關(guān)鍵且復(fù)雜的作用。不同腫瘤雖然在起源組織和突變上有著很大區(qū)別，但它們在與免疫系統(tǒng)的抗衡中都會創(chuàng)建對自身起到保護作用的腫瘤免疫微環(huán)境（TME）。

現(xiàn)有的腫瘤免疫研究通常會把腫瘤描述為“熱”（免疫浸潤）或“冷”（稀疏浸潤）腫瘤[2]。研究也已經(jīng)揭示了一些特定的免疫細胞亞群在腫瘤免疫中起到的作用以及它們之間的關(guān)系，如樹突狀細胞（cDC1，cDC2）[3, 4]，CD8/CD4 T細胞[3]，調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）[4]和自然殺傷（NK）細胞[5, 6]等。

然而，這些描述還并不完整，腫瘤TME中免疫細胞的組成是否與腫瘤生物學(xué)背景和其他細胞組成有關(guān)仍有待解答[7]。

近日，來自加州大學(xué)舊金山分校的Matthew F. Krummel教授團隊在《細胞》上發(fā)表了他們的免疫分析計劃（Immunoprofiler Initiative，IPI）的重要研究結(jié)果[8]。

他們提出，比起單一細胞類型的狀態(tài)，我們更應(yīng)該關(guān)注不同細胞的集合以及其他們綜合反映出的免疫狀態(tài)。Krummel團隊據(jù)此定義出了不同癌癥中的12種“免疫原型”（immune archetypes）。

他們發(fā)現(xiàn)，免疫原型不僅可以根據(jù)免疫基因表達區(qū)分腫瘤，還完善了腫瘤生物學(xué)分類。有趣的是，IPI研究中多次發(fā)現(xiàn)不同癌種可能來自同一免疫原型，并可作為評估預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)。這更新了現(xiàn)有的癌癥分類思路，未來針對調(diào)節(jié)特定免疫原型的療法或許能讓更多病人獲益。

論文首頁截圖

為了發(fā)現(xiàn)主要的免疫系統(tǒng)原型，IPI首先使用無偏見方法（即不知道腫瘤類型，分期和等級的情況下）統(tǒng)一收集和處理了來自12種不同癌癥的 364 個腫瘤樣本。

Krummel團隊將樣本快速消化成單細胞懸液，并使用多參數(shù)流式細胞術(shù)進行了免疫表型分析和細胞分選。樣本細胞被分為（1）所有活細胞，（2）常規(guī)CD4 和CD8 T細胞（Tconv ），（3）CD25 CD4 T細胞（Treg ），（4）HLA-DR 髓細胞，（5）CD45-CD44 Thy1 基質(zhì)細胞，和（6）所有其他CD45-細胞（癌細胞），并用這些細胞池進行了批量RNA測序（bulk RNA-Seq）。

IPI腫瘤樣本信息（活細胞批量RNA-seq樣本數(shù)，流式細胞分析樣本總數(shù)）和流式細胞分析和分選過程

Krummel團隊對分選后的腫瘤相關(guān)T細胞，髓細胞和基質(zhì)細胞的高質(zhì)量RNA-seq數(shù)據(jù)進行了差異基因表達（DGE）分析，分別篩選出了25個T 細胞基因，29個髓細胞基因，和21個基質(zhì)細胞基因。

通過用這三種基因特征，Krummel團隊為腫瘤樣本進行了評分，他們用基因評分測定的細胞豐度與流式細胞分析結(jié)果顯示出了高度一致。T 細胞，髓細胞和基質(zhì)細胞的Spearman相關(guān)性分別高達0.91，0.90，和0.94。

基因評分和流式細胞分析測定的T細胞，髓細胞和基質(zhì)細胞豐度結(jié)果

接下來，Krummel團隊用他們定義的3種細胞的基因特征分別對IPI和TCGA基因樣本進行了無監(jiān)督聚類分析（K-近鄰算法和Louvain社區(qū)發(fā)現(xiàn)算法）。

他們在IPI和TCGA數(shù)據(jù)中都發(fā)現(xiàn)了6個集群，即6種免疫原型。其中包括了兩個富集T細胞和髓細胞、由基質(zhì)細胞表達區(qū)分的富含免疫細胞的原型（以下簡稱為富含免疫[immune rich, IR]和富含免疫基質(zhì)[immune stromal, IS]）；基質(zhì)細胞的表達同樣區(qū)分了兩個缺少T細胞和髓細胞的免疫沙漠（immune desert, ID）和免疫基質(zhì)沙漠（immune stromal desert）原型。

最后兩個原型是僅富集一種免疫特征的T細胞（T cell centric, TC）原型和髓細胞（myeloid centric, MC）原型。

3特征聚類分析中產(chǎn)生的6種原型（3-f原型）

接下來，Krummel團隊通過分析六種免疫原型在IPI和TCGA樣本中的分布，試圖評估了簡單的原型分類是否與癌癥預(yù)后有關(guān)。

結(jié)果顯示，雖然一些腫瘤類型（如黑色素瘤，腎臟、膀胱和結(jié)腸直腸癌）的原型分類與生存結(jié)果有一定關(guān)系，但總的來說6種原型與多種癌癥的預(yù)后沒有顯著關(guān)系。于是作者們認為，僅用3種特征計算的原型無法涵蓋腫瘤免疫細胞的異質(zhì)性。

結(jié)合流式細胞分析數(shù)據(jù)，Krummel團隊細化了原算法中T細胞的分類。首先他們按癌癥類型對腫瘤進行了分組，以對比活細胞中Treg和CD4 或CD8 Tconv細胞的數(shù)量。這一步的結(jié)果顯示，不同腫瘤中的Treg和Tconv分數(shù)有很大差異。

不同癌癥中的Treg，CD4和CD8 T細胞數(shù)量

接下來，作者們用Treg RNA-seq與其他細胞的測序結(jié)果進行了DGE分析，找到了對應(yīng)Treg細胞的基因特征。

根據(jù)流式細胞分析數(shù)據(jù)，作者們選取了富含CD4和CD8 Tconv 的樣本進行DGE分析，找出了對應(yīng)的細胞基因。

加入新的基因特征之后，Krummel團隊接下來進行的6特征聚類分析產(chǎn)生了8個免疫原型。兩個新的原型分別是先前粗略IR和IS原型的細分，各產(chǎn)生了CD4和CD8偏差（CD4/CD8 biased IR/IS）的原型。

此外，之前3特征分析中的免疫基質(zhì)沙漠原型相對富含CD8，而ID則富含CD4 T細胞。

6特征聚類分析中產(chǎn)生的8種原型（6-f原型）

接下來，Krummel團隊對原型中的髓細胞特征也進行了細化。

眾所周知，髓細胞在組織中有著多變的分化和功能。因此，作者們首先用流式細胞分析探測了每種原型中的單核吞噬細胞（mononuclear phagocytes, MNP）亞群，包括單核細胞（Mo），巨噬細胞（Mp），經(jīng)典樹突狀細胞（cDC2，cDC1）和漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管原型之間略有不同髓細胞豐度的差異（如IR CD4偏差原型中cDC2的豐度高于cDC1），但總體來說，髓細胞的表達（包括cDC1/cDC2的比例，單核細胞和巨噬細胞豐度）在8種原型中都高度可變。

為了能更準(zhǔn)確的測量癌癥樣本中髓細胞的多樣性和密度，作者們對腫瘤相關(guān)MNP進行了單細胞測序（scRNA-seq），以確定主要的MNP亞群及他們的基因特征。

作者們首先通過3,880 個MNP細胞的基因聚類分析找到了5個集群，再進一步用每個集群之間的DGE分析得出了他們的特征基因。最后，他們用流式細胞分析驗證了這些MNP 子集的基因特征在腫瘤相關(guān)髓細胞的批量RNA-seq中生成的評分。MNP子集的基因與流式細胞分析評分在所有癌癥類型均呈高度相關(guān)（單核細胞，巨噬細胞，cDC2，cDC1和pDC的 Spearman相關(guān)性分別為 0.86，0.91，0.93，0.94 和 0.94）。

據(jù)此，Krummel團隊又在前6個特征的原型分析中添加了四個MNP子集特征（包括巨噬細胞，單核細胞和兩種經(jīng)典樹突狀細胞）。這10個免疫特征的聚類分析產(chǎn)生了 12 種不同的腫瘤免疫原型（10-f原型）。

10特征聚類分析中產(chǎn)生的12 種原型（10-f原型）

Krummel團隊發(fā)現(xiàn)，12種原型中，IR和ID原型都可以通過T細胞和髓細胞亞群的不同配對來區(qū)分。具體來說，單核細胞/巨噬細胞比例區(qū)分了兩種不同的IR CD8偏差原型，其中Treg的豐度通常在巨噬細胞富集的腫瘤標(biāo)本中較高。

10-f原型之間的細胞豐度對比

Krummel團隊接下來結(jié)合未用于聚類的基因數(shù)據(jù)進行了分析，以進一步闡明不同原型之間的免疫差異。

他們分析了髓細胞特征基因組和其他12個與免疫細胞（包括 Treg，Tconv，B 細胞，漿細胞和 NK 細胞亞型）有關(guān)的基因組在對應(yīng)細胞群中的表達（如Tconv RNA-seq中輔助性T細胞[Th1]基因的表達，髓細胞RNA-seq 中M1基因的表達等）。

組合基因組的分析結(jié)果揭示了每種原型之間不同的免疫反應(yīng)。例如，IR CD8巨噬細胞偏差（IR CD8 macrophage bias）原型的腫瘤樣本在 Tconv和MNP基因組中上調(diào)了1型反應(yīng)相關(guān)基因的表達（即干擾素γ[IFNγ]，腫瘤壞死因子[TNF]，白細胞介素[IL]-1β等），而ID CD8原型的樣本則上調(diào)了T細胞耗竭相關(guān)基因（PDCD1，CTLA4 和 ENTPD1）和M2樣巨噬細胞相關(guān)基因（PDCD1L2，CD163，CD274 和 MRC1）的表達。

10-f原型的免疫基因表達

作者們還發(fā)現(xiàn)，10-f 原型的分類有腫瘤生物學(xué)意義。

如之前所示，10-f腫瘤原型來自不同癌癥樣本，然而通過流式細胞術(shù)測量的腫瘤增殖力（Ki67 腫瘤細胞比例）結(jié)果顯示，ID和MC原型與高繁殖力有密切關(guān)系。

10-f原型腫瘤繁殖力對比

最后，Krummel團隊用TCGA數(shù)據(jù)進行了10-f原型在不同癌癥中的生存分析。

結(jié)果顯示，不同癌癥中更好的生存結(jié)果來自不同原型。也就是說，每種癌癥可能需要不同類型的TME來促進最佳免疫反應(yīng)。

進一步的多變量生存回歸分析結(jié)果顯示，具有相似T細胞亞群的原型之間有顯著的生存差異，而這一結(jié)果與起源組織無關(guān)。

例如，對比CD8 T細胞富集的原型時，相較于IS CD8， ID CD8，和巨噬細胞富集的IR CD8原型，單核細胞富集的IR CD8原型有著最好的生存結(jié)果（中位生存期3354 天，p=1.55E-12 )。反之，CD4 T 細胞富集的4種原型則沒有生存結(jié)果上的差異（p=3.01E-1）。

而在沒有T 細胞亞型偏差的原型中，以巨噬細胞比單核細胞富集為特征的TC原型有最高的中位生存期（2456 天，p=1.17E-6）。

T細胞亞型分類的10-f原型生存分析

總的來說，這項研究通過RNA-seq分析確定了不同癌癥TME中的細胞組成，并發(fā)現(xiàn)了12種腫瘤免疫原型。腫瘤原型為研究各種人類原發(fā)性癌癥中不同亞型的抗腫瘤免疫反應(yīng)，及其與腫瘤生物學(xué)背景之間的關(guān)系提供了新思路。

未來或許可以通過調(diào)節(jié)不同原型中特定的免疫機制在治療上給出個性化的最優(yōu)解。

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責(zé)任編輯丨代絲雨