單細胞多組學測序技術(shù)是指對一個單細胞同時檢測多個組學層面（例如基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組）的測序技術(shù)。這類技術(shù)可以更系統(tǒng)、全面地探索細胞異質(zhì)性以及同一個細胞內(nèi)的不同組學層面之間的互動關(guān)系，有利于更深入地解析復雜的生理、病理過程中細胞類型特異性的分子調(diào)控機制1, 2。2019年，Nature Methods雜志將單細胞多組學技術(shù)評為年度技術(shù)3。

DNA甲基化作為一種表觀遺傳標記，在生物發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生物學過程中發(fā)揮著重要作用。自從1992年以來，亞硫酸氫鹽（bisulfite）測序一直是DNA甲基化測序的金標準4。2012年，Benjamin P. Berman和Peter A. Jones團隊基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，細胞內(nèi)源DNA甲基化通常發(fā)生在CpG位點的特點，以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶M.CviPI具有對處于開放染色質(zhì)區(qū)域的GpC位點進行特異性甲基化的特點，開發(fā)了能夠用來同時檢測基因組（拷貝數(shù)變異）、DNA甲基組、染色質(zhì)狀態(tài)組的NOMe-seq技術(shù)1。在此基礎(chǔ)上，北大生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心湯富酬課題組和其他課題組分別開發(fā)了scCOOL-seq5和scNMT-seq6等單細胞多組學測序技術(shù)，能夠在單個細胞內(nèi)同時檢測基因組（拷貝數(shù)變異）、DNA甲基組、染色質(zhì)狀態(tài)組以及轉(zhuǎn)錄組。

然而，目前人們對單個細胞內(nèi)表觀基因組及其與轉(zhuǎn)錄組之間的互動關(guān)系的了解主要來自二代測序平臺（next generation sequencing, NGS），測序讀長通常為300bp。在生理或病理條件下，不同的表觀基因組層面（例如DNA甲基化與染色質(zhì)狀態(tài)）之間常常在相對較長的基因組區(qū)域內(nèi)相互作用7, 8。近年來，伴隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基于Oxford Nanopore或PacBio SMRT的三代測序平臺（third generation sequencing, TGS，也稱為單分子測序平臺）均能進行高通量長讀長測序，為長片段DNA上的表觀遺傳修飾的研究帶來了新的機遇。2022年，Nature Methods雜志將長讀長測序技術(shù)評為年度技術(shù)9。

涉及亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化處理的DNA甲基化測序方法（例如BS-seq）往往會導致DNA片段的斷裂和降解，因而無法獲得較長的DNA片段。2020年，Winston Timp團隊結(jié)合Nanopore測序平臺能夠直接檢測DNA分子上甲基化修飾的特點和NOMe-seq的測序原理，研究開發(fā)出了NanoNOMe這一大量細胞樣本（bulk sample）的多組學測序方法，可在較長的染色質(zhì)區(qū)域同時分析內(nèi)源性DNA甲基化以及染色質(zhì)可及性10。該方法需要0.5—1μg基因組DNA作為起始材料，不適用于胚胎等珍貴樣品以及腫瘤等具有高度細胞異質(zhì)性的樣品。人類單個二倍體細胞的基因組DNA僅有6pg左右，因此單細胞測序技術(shù)往往需要PCR擴增，而PCR擴增會導致擴增產(chǎn)物喪失DNA修飾信息?；谌鷾y序平臺的單細胞多組學測序技術(shù)仍然有待開發(fā)，與此同時，單細胞分辨率下不同層面表觀遺傳信息的長距離調(diào)控規(guī)律也有待進一步探索。

2023年9月12日，湯富酬課題組在Cell Research上發(fā)表了題為“scNanoCOOL-seq: a long-read single-cell sequencing method for multi-omics profiling within individual cells”的論文，首次報道了名為scNanoCOOL-seq的單細胞多組學測序技術(shù)。該技術(shù)整合了三代測序平臺（單分子測序平臺）和scCOOL-seq原理，能夠?qū)崿F(xiàn)在一個單細胞中同時精準檢測基因組（拷貝數(shù)變異）、DNA甲基化組、染色質(zhì)可及性以及轉(zhuǎn)錄組等多個組學層面的信息。

論文截圖

scNanoCOOL-seq技術(shù)主要采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和單接頭PCR擴增的策略，最終獲得長度約為900bp的基因組DNA擴增片段。如下圖所示，scNanoCOOL-seq技術(shù)的實驗流程主要包括：1）通過溫和的方式進行細胞裂解和體外M.CviPI酶加甲基化后，進行單細胞的核質(zhì)分離；2）單細胞的細胞核部分經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理和類PBAT策略的單接頭擴增后用于Nanopore平臺的單分子測序；3）單細胞的細胞質(zhì)部分用于scRNA-seq文庫構(gòu)建（優(yōu)化的STRT-seq）后進行轉(zhuǎn)錄組檢測（圖1）。利用K562和HFF1這兩個人類細胞系，該研究證實了scNanoCOOL-seq能夠精準檢測單個細胞的DNA甲基化組（圖2a, b）、染色質(zhì)可及性（圖2a, c）以及基因組（拷貝數(shù)變異）（圖2d），其檢測準確性與基于二代測序平臺的scCOOL-seq技術(shù)相當，但是測序讀長從原來的300bp增加到900bp。

圖1. scNanoCOOL-seq技術(shù)的實驗流程圖

圖2. scNanoCOOL-seq技術(shù)的檢測性能

該研究在多個方面對scNanoCOOL-seq技術(shù)的應(yīng)用進行了探索：

1. scNanoCOOL-seq能夠在單個細胞中以單分子分辨率精準檢測DNA甲基化以及染色質(zhì)可及性等表觀遺傳特征

相對于scCOOL-seq，scNanoCOOL-seq在長讀長方面的優(yōu)勢主要包括以下兩點：1）數(shù)據(jù)顯示，人類基因組中的CpG島（CpG island, CGI）的中位數(shù)長度為575bp。基于二代測序平臺的測序數(shù)據(jù)（通常雙端300bp）往往無法在單分子水平完全覆蓋整個CpG島。而作為重要的調(diào)控元件，從單分子水平完整檢測CpG島中的DNA甲基化修飾有利于更好地研究CpG島甲基化對基因表達的調(diào)控作用。該研究證實基于三代測序平臺的scNanoCOOL-seq能夠在每個單細胞中完整覆蓋數(shù)百個CpG島和基因啟動子區(qū)域，當單細胞數(shù)量增加至400個左右時被完整覆蓋的CpG島和基因啟動子數(shù)量增加至總數(shù)的90%左右（圖3a, b）；2）基于二代測序平臺的測序方法難以用于檢測基因組中的復雜結(jié)構(gòu)變異（structural variations, SVs），如染色體易位等基因組區(qū)域的表觀遺傳修飾。該研究發(fā)現(xiàn)基于三代測序平臺的scNanoCOOL-seq可以在單分子分辨率準確檢測K562細胞中由于染色體易位導致的BCR-ABL1融合基因以及相應(yīng)的野生型等位基因的DNA甲基化以及染色質(zhì)可及性特征（圖3c）。另外，scNanoCOOL-seq也能精準檢測印記基因的印記調(diào)控區(qū)域的親本特異性DNA甲基化模式（圖3d）。

圖3. scNanoCOOL-seq以單分子分辨率檢測全長CpG島、基因啟動子、染色質(zhì)易位事件的表觀遺傳特征及親本特異性DNA甲基化

2. scNanoCOOL-seq能夠精準檢測細胞中DNA甲基化動態(tài)變化以及染色質(zhì)可及性的異質(zhì)性

5-氮雜胞嘧啶（5-aza）是一種常見的去甲基化藥物。該研究以5-氮雜胞嘧啶處理K562細胞作為生物學模型探究scNanoCOOL-seq在檢測DNA甲基化和染色質(zhì)可及性的動態(tài)變化和異質(zhì)性上的能力（圖4a）。結(jié)果表明，與預(yù)期相符，在經(jīng)過5-氮雜胞嘧啶連續(xù)5天處理的K562細胞中DNA甲基化水平持續(xù)下降，而在對照組K562細胞中DNA甲基化水平維持不變（圖4b, c）。不僅如此，在經(jīng)過5-氮雜胞嘧啶處理后K562細胞的全基因組DNA甲基化呈現(xiàn)出異質(zhì)性增加的趨勢（圖4d）。為研究K562細胞響應(yīng)去甲基化藥物后基因表達模式的動態(tài)變化，該研究進行了擬時間分析和功能富集分析。結(jié)果顯示，K562細胞在響應(yīng)5-氮雜胞嘧啶處理過程中，表達水平下調(diào)的基因主要富集在細胞器分裂、染色體分離、核糖體生物合成、rRNA代謝過程和rRNA加工等生物學過程，而表達水平上調(diào)的基因主要是與白細胞趨化、免疫細胞增殖和激活等相關(guān)的基因。

圖4. scNanoCOOL-seq檢測K562細胞響應(yīng)去甲基化藥物后的動態(tài)變化和異質(zhì)性

3. scNanoCOOL-seq能夠精準刻畫小鼠囊胚發(fā)育過程中表觀基因組中的細胞譜系特異性特征

哺乳動物在著床前發(fā)育過程中經(jīng)歷了顯著且關(guān)鍵的表觀遺傳重編程和細胞命運決定11。第一次細胞命運決定時早期囊胚分化成多能性內(nèi)細胞團（inner cell mass, ICM）和滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm, TE）。第二次細胞命運決定發(fā)生時晚期囊胚階段的內(nèi)細胞團細胞進一步分化為上胚層（epiblast,Epi）和原始內(nèi)胚層（primitive endoderm,PrE）（圖5a）。已知在隨后的發(fā)育過程中，上胚層細胞將發(fā)育成整個胚胎，而原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層細胞將發(fā)育成胚外組織11。盡管已經(jīng)對哺乳動物的早期胚胎發(fā)育進行了廣泛的研究5, 11，仍然還沒有在單細胞水平和多組學層面解析囊胚發(fā)育過程中表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化以及其互動關(guān)系。

該研究利用scNanoCOOL-seq技術(shù)在單細胞分辨率下系統(tǒng)地描繪了小鼠囊胚期胚胎中表觀基因組多個組學層面的動態(tài)變化（圖5b）。該研究發(fā)現(xiàn)，1）在晚期囊胚（E4.5）中，原始內(nèi)胚層細胞中基因體（gene body）區(qū)的DNA甲基化水平（22.8%）高于上胚層細胞（18.8%），而滋養(yǎng)外胚層細胞中基因體區(qū)域的DNA甲基化水平（15.1%）最低。在晚期囊胚中，滋養(yǎng)外胚層細胞基因體區(qū)域的平均染色質(zhì)可及性水平高于上胚層和原始內(nèi)胚層細胞（圖5b）。2）早期雌性（XX）囊胚的內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)外胚層細胞中尚未完成印記式的X染色體失活（imprinted X chromosome inactivation, iXCI，父源X染色體特異性失活），而晚期雌性囊胚的原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層細胞都顯示出已經(jīng)完成了印記式的X染色體失活。與原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層細胞不同，晚期雌性囊胚的上胚層細胞中有部分父源X染色體已經(jīng)重新激活，并為后續(xù)發(fā)育階段X染色體隨機失活（random X chromosome inactivation, rXCI）做好準備（圖5c）。3）與上胚層細胞相比，晚期囊胚中的滋養(yǎng)外胚層細胞的母源基因組DNA甲基化具有更強的鏈偏向性和更低的DNMT1表達量，說明在滋養(yǎng)外胚層細胞中發(fā)生了更強烈的DNA被動去甲基化（在DNA復制過程中，DNA新生鏈上沒有完全補上甲基化修飾）（圖5d）。

圖5.scNanoCOOL-seq檢測小鼠囊胚不同譜系的鑒定、表觀組動態(tài)變化、等位基因特異性轉(zhuǎn)錄組和鏈特異性的表觀基因組

綜上所述，基于單分子測序平臺的scNanoCOOL-seq技術(shù)能夠?qū)σ粋€單細胞同時進行基因組（拷貝數(shù)變異）、DNA甲基化組、染色質(zhì)可及性以及轉(zhuǎn)錄組測序分析。利用長讀長測序的優(yōu)勢，scNanoCOOL-seq可以檢測全長CpG島和基因啟動子區(qū)域的多重表觀遺傳特征以及不同組學層面間的互動關(guān)系。此外，scNanoCOOL-seq還可以在單分子分辨率檢測染色體易位等復雜基因組結(jié)構(gòu)變異事件產(chǎn)生的表觀遺傳改變，同時也為在單個細胞中對等位基因特異性的表觀遺傳特征以及DNA鏈特異性的表觀遺傳特征的研究提供了強大的工具。

北京大學前沿交叉學科研究院博士生林建立、薛曉慧為該論文的并列第一作者。湯富酬為該論文的通訊作者。該研究項目得到了國家自然科學基金基礎(chǔ)科學中心項目、科技創(chuàng)新2030-“腦科學與類腦研究”重大項目的資助。

參考文獻：

1 Kelly TK, Liu Y, Lay FD, Liang G, Berman BP, Jones PA. Genome-wide mapping of nucleosome positioning and DNA methylation within individual DNA molecules. Genome research 2012; 22:2497-2506.

2 Pott S. Simultaneous measurement of chromatin accessibility, DNA methylation, and nucleosome phasing in single cells. Elife 2017; 6.

3 Method of the Year 2019: Single-cell multimodal omics. Nature methods 2020; 17:1-1.

4 Liu Y, Siejka-Zielinska P, Velikova G et al. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. Nat Biotechnol 2019; 37:424-429.

5 Guo F, Li L, Li J et al. Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells. Cell Res 2017; 27:967-988.

6 Clark SJ, Argelaguet R, Kapourani C-A et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature communications 2018; 9:781.

7 Xu C, Corces VG. Nascent DNA methylome mapping reveals inheritance of hemimethylation at CTCF/cohesin sites. Science 2018; 359:1166-1170.

8 Bell AC, Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 2000; 405:482-485.

9 Method of the Year 2022: long-read sequencing. Nature methods 2023; 20:1-1.

10 Lee I, Razaghi R, Gilpatrick T et al. Simultaneous profiling of chromatin accessibility and methylation on human cell lines with nanopore sequencing. Nature methods 2020; 17:1191-1199.

11 Wang Y, Yuan P, Yan Z et al. Single-cell multiomics sequencing reveals the functional regulatory landscape of early embryos. Nat Commun 2021; 12:1247