【原】技術(shù)介紹 | 詳解 ATAC-Seq

生信藥丸 2024-04-05 發(fā)布于貴州

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ATAC-seq，全稱 Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing，是 2013 年由斯坦福大學(xué) William J. Greenleaf 和 Howard Y. Chang 實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的用來研究染色質(zhì)可及性（通常也理解為染色質(zhì)的開放性）的方法。

真核生物的核 DNA 并不是裸露的，而是組蛋白與之結(jié)合。DNA 一圈一圈地纏繞在 8 個組蛋白上，形成核小體，每個核小體占了約 147bp 的 DNA。一個個核小體構(gòu)成了串珠樣的結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)一步折疊、聚合，并在其他架構(gòu)蛋白的協(xié)助下，形成染色體。這樣就能將超長的 DNA 鏈，折疊成很小很小的結(jié)構(gòu)，塞進(jìn)小小的細(xì)胞核里。

但是在基因轉(zhuǎn)錄的過程中，并非需要完全解開 DNA 鏈的全部結(jié)構(gòu)，而是只需部分解開，即表達(dá)基因的區(qū)域。這一步驟主要依賴于染色體組蛋白的修飾，尤其是乙?；?。被打開的染色質(zhì)稱為開放染色質(zhì)（open chromatin）。一旦染色質(zhì)打開，調(diào)控蛋白（例如轉(zhuǎn)錄因子）就有機(jī)會結(jié)合其中。染色質(zhì)的可及性是指染色質(zhì)打開的特性，主要由染色體組蛋白的修飾實(shí)現(xiàn)，因此染色質(zhì)的可及性反映了調(diào)控因子與開放染色質(zhì)結(jié)合的程度，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。通過研究特定細(xì)胞狀態(tài)下開放的染色質(zhì)區(qū)域，我們能夠在 DNA 水平上了解其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

研究開放染色質(zhì)區(qū)域的技術(shù)

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法主要包括 MNase-seq 和 DNase-seq，它們的主要思路是：當(dāng)染色質(zhì)變得開放時，DNA 和組蛋白的聚集程度降低，導(dǎo)致一部分 DNA 暴露出來。失去蛋白質(zhì)的保護(hù)后，這部分 DNA 可被 DNA 酶（如 MNase 或 DNase I）切割。隨后，我們對切割后的 DNA 進(jìn)行測序，并將其與已知的全基因組序列進(jìn)行比較，以確定哪些序列被切割，哪些基因序列未受影響，從而確定開放的染色質(zhì)區(qū)域。但是這兩種方法存在明顯的缺陷，主要表現(xiàn)在耗時費(fèi)力和重復(fù)性差的問題。

還有 FAIRE-Seq，先進(jìn)行超聲裂解，然后用酚-氯仿富集，不依賴酶和抗體，但弊端就是檢測背景高，測序信噪比低，甲醛交聯(lián)時間不好把握等等。

ChIP-Seq 是揭示特定轉(zhuǎn)錄因子或蛋白復(fù)合物的結(jié)合區(qū)域，實(shí)際是研究 DNA 和蛋白質(zhì)的相互作用，利用抗體將蛋白質(zhì)和 DNA 一起富集，并對富集的 DNA 測序。

整體的分析思路一致，這些技術(shù)找富集區(qū)域，對富集區(qū)域進(jìn)行功能分析。

相比起來，ATAC-seq 是用 Tn5 轉(zhuǎn)座酶，操作起來也更加簡單，重復(fù)性好，而且最重要的一點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)只需要很少的細(xì)胞/組織量，出來的信號也更加漂亮，所以 ATAC-seq 目前已經(jīng)是研究染色質(zhì)開放性首選的技術(shù)方法。

ATAC-seq 技術(shù)

ATAC-seq 技術(shù)用到了一個轉(zhuǎn)座酶 Tn5：DNA 轉(zhuǎn)座是一種由 DNA 轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)，把 DNA 序列從染色體的一個區(qū)域插入到另外一個區(qū)域的現(xiàn)象，類似于“剪切粘貼”。這個過程，也是需要插入位點(diǎn)的染色質(zhì)是開放的，否則就會被一大坨高級結(jié)構(gòu)給卡住。

轉(zhuǎn)座酶可以隨機(jī)結(jié)合并切割染色質(zhì)開放區(qū)的 DNA，并且可同時在切割位點(diǎn)插入接頭序列。只要將攜帶已知 DNA 序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座復(fù)合物（即帶紅色和藍(lán)色序列標(biāo)簽的 Tn5 轉(zhuǎn)座酶）加入到細(xì)胞核中一起孵育，再利用已知序列標(biāo)簽進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增即可形成文庫，經(jīng)過測序就可以獲得染色質(zhì)開放區(qū)的信息。

ATAC-seq 實(shí)驗(yàn)流程

一般來說包括以下幾個步驟：

細(xì)胞核制備
片段化及 DNA 提取
PCR 擴(kuò)增
文庫純化
高通量測序
數(shù)據(jù)分析

ATAC-seq 技術(shù)的優(yōu)勢

所需細(xì)胞量較低，而且信噪比高、特異性強(qiáng)、耗時短
滿足動物、植物、人等樣本的要求，具有很好的物種適應(yīng)性
單細(xì)胞測序技術(shù)是近幾年研究的熱點(diǎn)，通過對單個細(xì)胞的測序能夠?qū)⒈碛^遺傳學(xué)研究個體化。常見的 ChIP-seq、DNase-seq、MNase-seq 等技術(shù)無法進(jìn)行單細(xì)胞測序，而 ATAC-seq 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明其能夠進(jìn)行單細(xì)胞測序

ATAC-seq 技術(shù)的應(yīng)用

那么說了這么半天的 ATAC-seq 歸根到底是用來干嘛呢？主要有以下應(yīng)用

染色質(zhì)開放性圖譜繪制，表觀基因組圖譜
找調(diào)控生物學(xué)過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
找哪個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了研究的基因
找轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶基因
得到不同組織或不同條件下對應(yīng)可及性區(qū)域。
得到核小體位置
生成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的特征 (footprinting)

ATAC-seq 適用于機(jī)制研究，探索信號通路、表型變化、疾病等與基因調(diào)控的相關(guān)性。并以其簡便高效、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，成為研究染色質(zhì)開放區(qū)的有效技術(shù)方法。

在表觀遺傳研究中，ATAC-seq 能夠探索表觀修飾是否與研究目標(biāo)有相關(guān)性，可通過 Open Chromatin 區(qū)域和 Motif 分析尋找參與基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。ATAC-seq、CUT&Tag 和 RNA-seq 等方法技術(shù)能夠助力科研人員進(jìn)行相關(guān)研究

ATAC-seq 的技術(shù)限制

Tn5 通過插入剪斷 DNA 并將測序接頭連接到剪斷的兩個 DNA 片段的末端，因此對于一個 DNA 片段而言，其兩端的接頭連接是隨機(jī)的，導(dǎo)致同一片段兩端的接頭有 50%的概率是同一接頭。而只有連接不同接頭的片段才可用于富集擴(kuò)增及測序，因此一半的片段無法利用
大量剪斷的 DNA 由于片段過大，無法進(jìn)行 PCR 富集
Tn5 的活性受反應(yīng)溶液的組成及反應(yīng)條件影響，仍然需要優(yōu)化以便提高剪切效果
ATAC-seq 在植物細(xì)胞存中存在細(xì)胞壁、葉綠體線粒體等細(xì)胞器污染，缺少穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系等問題