【原】圖解原代細胞 | 第5期. 一文搞定肺組織原代成纖維細胞

新用戶4064dVjo 2024-04-25 發(fā)布于北京

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在前面的推送中，我們一起學習了脾臟T細胞、肺動脈平滑肌細胞、骨髓BMDM（詳見基礎科研系列合集）提取方法和特性，還提及原代細胞提取的共性要點，今天我們將進一步學習肺組織中另一類重要的細胞——成纖維細胞，利用原代細胞常用的提取方法：酶解法和組織貼壁法實現(xiàn)肺原代成纖維細胞的成功提取與培養(yǎng)。

準備工作

試劑和器械

高糖 DMEM培養(yǎng)基( Gibco) ，胎牛血清( FBS，Gibco) ，磷酸緩沖鹽溶液( PBS，Gibco) ，Hank’s 平衡鹽溶液(HBSS，Gibco)，0.25%胰蛋白酶( Gibco, 25200-056)，膠原酶/分離酶 (Roche, 10269638001)，DMSO( Sigma) ，75%酒精，T25培養(yǎng)瓶，10cm培養(yǎng)皿，移液器，槍頭，滅菌的取材器械

操作流程

取材、分離培養(yǎng)、傳代、鑒定

小鼠肺組織的取材

（所有步驟均應在無菌條件下進行）

（1）脫椎處死小鼠，用75%酒精浸泡噴灑小鼠體表，從頸部打開胸腔（避免與腹腔相通，減少污染風險），暴露肺組織。

（2）快速取出肺組織，放入裝有2ml HBSS 的10 cm 培養(yǎng)皿中，去除周圍結(jié)締組織，加入適量 HBSS沖洗 2-3 遍，至肺組織微微發(fā)白以減少肺組織中的紅細胞。

原代成纖維細胞的分離培養(yǎng)

（酶解法和組織貼壁法）

2.1

酶解法：培養(yǎng)周期短，操作步驟簡單

（1）將肺組織置于新的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將肺組織充分剪碎至呈糊狀（如圖1）。

圖1 組織剪碎成糊狀^[1]

（2）將剪碎的組織轉(zhuǎn)移至1.5ml ep管，每50mg肺組織加入0.5ml 濃度為1mg/ml膠原酶/分離酶(Roche, 10269638001)，確保組織充分解離;

（3）在37℃、 CO2培養(yǎng)箱中，解離30 分鐘。

（4）室溫下1000 x g 離心5分鐘，去上清。

（5）加入1ml HBSS 洗滌細胞，室溫下1000 x g 離心5分鐘，去上清。

（6）每50mg肺組織加入0.5ml 0.25%胰蛋白酶再次酶解細胞，37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘。

（7）室溫下1000 x g 離心5分鐘，去上清。

（8）用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，6孔板鋪板，置于 5% CO2 、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

圖2 顯微鏡下觀測到6孔板中的成纖維細胞^[1]

2.2

組織貼壁法：培養(yǎng)周期長，但獲得的原代細胞相對更純

（1）將肺組織轉(zhuǎn)移至10cm 培養(yǎng)皿中剪碎至糊狀，加入 200μL胎牛血清，混勻。

（2）用 1 mL 一次性無菌吸管吸取肺組織均勻鋪于 T25培養(yǎng)瓶中，此過程應將肺組織碎塊充分分離鋪勻，每個組織塊之間間隔約1 mm（每只小鼠肺組織可接種 2-3個 T25培養(yǎng)瓶）。

圖3 肺組織塊均勻鋪于 T25 培養(yǎng)瓶示意圖^[2]

（3）（關鍵步驟：組織貼片牢固貼壁）

將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)倒置（組織貼壁面朝上），向培養(yǎng)瓶中加入 2 mL含 12%-15%的 FBS的 DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中干貼壁 2 h（此步驟防止組織片缺水干燥）。

（4）干貼壁2 h后，緩慢翻轉(zhuǎn)正置培養(yǎng)瓶，此時培養(yǎng)基與組織塊淺淺接觸。

（5）置于 5% CO2 、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2 天更換培養(yǎng)基，操作應緩慢，避免組織塊漂浮，連續(xù)培養(yǎng)7-9天（部分肺組織細胞生長緩慢，可適當延長培養(yǎng)時間）。

（6）7-9 天后，可觀察到組織塊周圍有大量成纖維細胞爬出。

圖4 大量原代成纖維細胞從組織團塊中爬出[3]

原代成纖維的傳代

（1）第一次傳代時間：酶解法獲得的成纖維細胞培養(yǎng)到70-90%密度；組織貼壁法孵育7-9天后的細胞進行第一次傳代。

（2）傳代方法：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，PBS洗1-2次，胰蛋白酶消化40-60秒，1:2傳代。置于5% CO2 、37 ℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

（3）傳代次數(shù)：第一次傳代后，每2-4天根據(jù)細胞密度換液或1:2傳代，建議選取2-10代的原代細胞用于后續(xù)實驗或凍存。

原代成纖維的鑒定

（1）細胞形態(tài)：鏡下觀察成纖維細胞成長索形、條索狀。

（2）免疫熒光：

圖5 鬼筆環(huán)肽（Phalloidin )或α-平滑肌肌動蛋白（(alpha-SMA)免疫熒光染色為陽性[3]

（3）qPCR鑒定:

圖6 qPCR 檢測肺成纖維細胞相關基因的表達[3]

以上就是今天的分享內(nèi)容啦，大家可以根據(jù)實驗需求選取耗時更短的酶解法或純度更高的貼壁法，按照上述步驟操作就能獲得理想的原代成纖維細胞！

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參考文獻：

[1] EDELMAN B L, REDENTE E F. Isolation and Characterization of Mouse Fibroblasts[M/OL]//ALPER S, JANSSEN W J. Lung Innate Immunity and Inflammation: Methods and Protocols. New York, NY: Springer, 2018: 59-67[2024-04-24].

[2] 改良組織法高效分離純化成年小鼠肺成纖維細胞--《中華中醫(yī)藥學刊》2018年12期[EB/OL]. [2024-04-24].

[3] FUENTES-MATEOS R, SANTOS E, FERNáNDEZ-MEDARDE A. Optimized Protocol for Isolation and Culture of Murine Neonatal Primary Lung Fibroblasts[J/OL]. Methods and Protocols, 2023, 6(1): 14[2024-04-24].

[4] 王嘉陵鄧佳慧肖軍花. 成年小鼠肺成纖維細胞的分離純化及原代培養(yǎng)[J/OL]. 基礎醫(yī)學與臨床, 2012, 32(6): 713[2024-04-24].

[5] Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents[EB/OL]. [2024-04-24].

讓醫(yī)學科研有跡可循