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皮膚是人體最大的器官，是保護身體免受外部環(huán)境不利因素影響的第一道防線，其面積為1.5～2.0 m2，約占一個成年人體質(zhì)量的15%［1］。另一方面，皮膚也提供了一個頗具吸引力的給藥途徑，避免了藥物在胃腸道或肝臟中降解，并能持續(xù)、可控地釋放藥物。經(jīng)皮給藥作為一種替代口服和注射的給藥方式，已廣泛應用于各種疾病的治療。 角質(zhì)層是藥物透過皮膚的主要屏障，主要由10～20層扁平、無細胞核的角質(zhì)細胞堆砌而成［2-3］。角質(zhì)細胞內(nèi)部充滿密集平行的角蛋白中間絲，并且被無定形絲聚蛋白所包裹。角質(zhì)細胞間隙的基質(zhì)主要由脂質(zhì)如神經(jīng)酰胺、膽固醇和脂肪酸等組成，這些脂質(zhì)以多層雙分子薄片的形式存在［2-3］。藥物要想穿透角質(zhì)層有2種途徑，一是細胞間途徑，藥物通過連續(xù)的細胞間脂質(zhì)進入活性表皮層；二是跨細胞途徑，藥物穿過角質(zhì)細胞到達活性表皮層。藥物穿過細胞時需要經(jīng)多次親水/親脂區(qū)域的分配過程，導致跨細胞途徑對藥物經(jīng)皮吸收貢獻極?。?-5］。 除了角質(zhì)層外，皮膚附屬器（毛囊、汗腺和皮脂腺）也為藥物穿透皮膚提供了另一條途徑［5］。因皮膚附屬器僅占皮膚面積的0.1%左右，該途徑不是藥物經(jīng)皮吸收的主要途徑。因此，藥物分子主要經(jīng)細胞間質(zhì)途徑進入皮膚深層，繼而吸收入體循環(huán)。通常認為，只有親脂性適中（油水分配系數(shù)1～5）且相對分子質(zhì)量＜500的中性分子可以較好地通過細胞間的脂質(zhì)區(qū)域［6-7］。因此如何有效提升不具備理想理化性質(zhì)的化合物（如親水性化合物、生物大分子）的皮膚吸收一直是經(jīng)皮給藥領(lǐng)域的首要問題。 目前，多種多樣的物理和化學促滲技術(shù)已被開發(fā)出來，并應用于臨床。其中，常見的物理促滲技術(shù)包括離子導入［8］、超聲導入［9］、電致孔［10］、微針［11］、熱消融［12］和射頻消融［13］，而化學促滲技術(shù)主要涉及到離子對和滲透促進劑的使用。其中，化學滲透促進劑已廣泛用于許多經(jīng)皮給藥制劑和化妝品，如二甲基亞砜（DMSO）［14-15］、氮酮［16］、脂肪酸類［17］、醇類［18］。它們主要通過破壞角質(zhì)層的脂質(zhì)雙分子層、與蛋白質(zhì)相互作用或改變藥物在角質(zhì)層中的分配系數(shù)來促進藥物對皮膚的滲透［5］。然而化學滲透促進劑高濃度使用可能會引起皮膚瘙癢、發(fā)炎和脫屑等不良反應，長期使用甚至可能引發(fā)皮膚疾病，部分患者接受度低［15，19］。作 為新型具有生物學背景的促滲劑，皮膚穿透肽（SPP）是一類具有促滲效果的短肽（少于30個氨基酸殘基），多為陽離子肽（主要由精氨酸和賴氨酸組成）或兩親性肽（主要由賴氨酸組成，序列中還分布有親水性或疏水性的其他氨基酸殘基）［20］。與傳統(tǒng)的化學滲透促進劑相比，SPP具有良好的生物相容性、序列構(gòu)建多樣性的優(yōu)點［20-23］，展示了良好的臨床應用前景。本文總結(jié)了近年來關(guān)于SPP的研究成果，重點闡述了SPP的來源與分類、作用機制及其應用方式，為SPP的發(fā)展和創(chuàng)新提供有價值的參考。 1 SPP的來源與分類SPP最初源于細胞穿膜肽。鑒于細胞穿膜肽具有穿透脂質(zhì)雙分子層和組織屏障的能力，Rothbord等［24］將聚精氨酸七聚物（R7，一種常用的細胞穿膜肽）共價連接到環(huán)孢素A，顯著增強了環(huán)孢素A的透皮吸收，并有效抑制皮膚急性炎癥反應，由此產(chǎn)生了新型的透皮促滲劑—SPP。隨后，科研人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些細胞穿膜肽也具有皮膚促滲效果，促進藥物的皮膚吸收。直至Chen等［25］使用噬菌體展示技術(shù)（PDT）篩選出透皮短肽TD-1，才真正意義上開始針對SPP的研究。目前按照來源，SPP可分為3類：蛋白質(zhì)來源的SPP、基因重組來源的SPP和人工設(shè)計合成的SPP（表1）。   1.1 蛋白質(zhì)來源的SPP蛋白質(zhì)來源的SPP是由天然蛋白質(zhì)或其片段衍生而來的短肽。這些肽具有獨特的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特性，使其能夠穿透細胞膜。由于其天然來源，通常具有較低的免疫原性，不易引起免疫反應［57-58］。TAT-PTD是最早發(fā)現(xiàn)的細胞穿膜肽。Frankel課題組和Green課題組分別于1988年報道了人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的TAT蛋白可以被細胞跨膜攝取并轉(zhuǎn)移到細胞核中［59-60］。自然界中這類天然存在的多肽能夠安全有效地實現(xiàn)外源生物大分子的跨膜轉(zhuǎn)導，被稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域（PTD）家族。 TAT中含有一個與蛋白轉(zhuǎn)導功能密切相關(guān)的多肽片段（富含堿性氨基酸且?guī)д姾桑?，進一步研究證實，TAT中第47～57位的11個氨基酸殘基（YGRKKRRQRRR）可獨立穿過多種類型的細胞膜，穿膜效率比全長TAT還要高，于是此段肽鏈被歸為TAT蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域（TAT-PTD）［61］。TAT-PTD可遞送雙氯芬酸鈉［49］、熱休克蛋白P20［54］、人類酪氨酸酶質(zhì)粒［62］、鹽酸利多卡因（LID）［63］、降鈣素［64］和塞來昔布［65］等藥物進入皮膚，并發(fā)揮良好的治療作用。 Penetratin來源于果蠅觸角蛋白異型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白ANTP。ANTP是比較經(jīng)典的細胞穿膜肽之一。ANTP由60個氨基酸序列組成，包含3個α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中第3螺旋結(jié)構(gòu)中的16個氨基酸多肽片段（43～58位）在蛋白轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，該多肽序列即為Penetratin［66］。Penetratin可有效增強卵清蛋白（OVA257～264、OVA8）的穿透皮膚表面能力，從而引發(fā)高水平的OVA特異性CD8+T細胞應答［27］。Penetratin修飾的微乳顯著增加紫杉醇活性表皮層和真皮層的沉積量［67］。 低分子量魚精蛋白（LWMP）是天然魚精蛋白通過酶消化產(chǎn)生的肽片段。LWMP成本低、易于批量生產(chǎn)，是目前研究比較廣泛的細胞穿膜肽。LMWP與TAT-PTD具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性，其結(jié)構(gòu)也有10個精氨酸殘基，與TAT-PTD的促滲機制也相似［68］。LMWP與OVA結(jié)合后，可以顯著提高OVA穿透皮膚的能力［69］。LMWP修飾的聚乙烯亞胺/DNA復合物（PEI/DNA）納米粒的皮膚累積透過量明顯優(yōu)于未修飾的PEI/DNA納米粒［70］。 除TAT、ANTP和LMWP，從家蠶的30kc19蛋白中發(fā)現(xiàn)的Pep-c19［43］，人源蛋白中得到的IMT-P8［34］和來源于非洲爪蟾皮膚的蛙皮素［56］，人類蛋白磷酸酶中發(fā)現(xiàn)的Mgpe-9［37］，從人類轉(zhuǎn)錄因子中鑒別出的Hph-1-PTD等蛋白質(zhì)來源的細胞穿膜肽同樣具有促進透皮吸收的作用［33］。目前所知，僅少數(shù)細胞穿膜肽具有皮膚促滲的作用。因此，天然蛋白質(zhì)序列是有限的，可能限制了SPPs的創(chuàng)新與發(fā)展。 1.2 基因重組來源的SPP這類SPP是通過基因工程技術(shù)（如常用的PDT）篩選得到的短肽。PDT為開發(fā)新型SPP提供一種高效的手段。它將外源肽的編碼基因插入噬菌體（通常是M13、T4或T7噬菌體）的外殼蛋白基因中，構(gòu)建噬菌體展示文庫。噬菌體展示文庫可以包含大量不同的肽序列，增加篩選成功的可能性?；赑DT發(fā)現(xiàn)的SPP主要通過“生物淘洗法”得到。通常其流程是先將噬菌體顆粒應用到活體/離體皮膚上，再收集、擴增可以穿透皮膚的噬菌體，將這些可以穿透皮膚的噬菌體再次應用到皮膚上。 經(jīng)過幾輪篩選后，通過穿透噬菌體的基因組DNA測序，鑒定可以持續(xù)穿透進入皮膚的肽序列。經(jīng)篩選鑒定的肽通過透皮實驗進一步評價其促滲效果［25，71］。其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在，可從數(shù)以億計的氨基酸序列中篩選出目標肽SPPs，實現(xiàn)高通量篩選。但是，找到高效穿透皮膚屏障的肽序列可能需要多輪篩選和優(yōu)化，過程耗時較長。篩選得到的肽序列通常生物相容性較好，但在實際應用中仍需評估其潛在的免疫原性和毒性。 Chen等［25］利用體內(nèi)PDT篩選得到一種具有11個氨基酸由二硫鍵成環(huán)的短肽TD-1（ACSSSPSKHCG）。TD-1是第一個被報道能通過經(jīng)皮給藥途徑有效攜帶蛋白質(zhì)藥物（胰島素）的SPP。TD-1具有序列特異性和濃度依賴性，缺失其中的某些氨基酸都會降低透皮速率，并且隨著TD-1濃度的升高，透皮增強效果也隨之提高［25］。 Hsu和Mitragotri使用離體豬皮進行PDT篩選，獲得可以同時增強大分子穿透活性表皮和真皮細胞膜的SPACE肽和DLP［31］。這2個多肽在人體皮膚、小鼠皮膚、豬皮上均可實現(xiàn)高效穿透。其中關(guān)于SPACE肽研究開展的更加廣泛［19］，例如siRNA［72］、環(huán)孢素A［36］、透明質(zhì)酸［73］等。由于大多數(shù)SPP（包括TD-1、SPACE肽等）肽鏈較長，出于方便合成以及降低成本考慮，Kumer等［50］篩選出更短的線性肽T2（LVGVFH），這種肽不需與藥物結(jié)合就能發(fā)揮促滲作用。Gennari等［32］也利用PDT篩選了用于增強肝素皮膚滲透的七肽DRTTLTN。 1.3 人工設(shè)計合成的SPP人工設(shè)計合成的SPP是根據(jù)天然蛋白質(zhì)和基因重組來源SPP的特點設(shè)計得到的新SPP。該方法不受限于天然肽或蛋白質(zhì)的序列，可以探索新的序列組合和功能，提高創(chuàng)新性［30，46，74］。較早發(fā)現(xiàn)的天然來源細胞穿膜肽（如TAT、ANTP）的一個典型特征是其中含有高濃度的精氨酸或者其他堿性帶正電的氨基酸。聚精氨酸（Rn）在進入細胞時比賴氨酸、鳥氨酸或組氨酸組成的類似長度聚合物更有效，這表明精氨酸在穿透細胞膜過程中起著重要的作用［75］。 Rothbord等［24］首次將聚精氨酸（R7）應用到皮膚滲透研究中，以提高環(huán)孢素A的跨皮膚轉(zhuǎn)運。聚精氨酸的皮膚滲透深度取決于施用精氨酸的數(shù)量和濃度。Shah等［76］比較了不同數(shù)量精氨酸的序列增強納米脂質(zhì)載體促進皮膚滲透的能力，精氨酸數(shù)量從8增加到11時，皮膚滲透能力增強；精氨酸數(shù)量從11增加到15時，皮膚滲透能力降低，這被歸因于精氨酸的長度導致的飽和效應或空間位阻。 需要指出的是，不同藥物可能需要不同長度的聚精氨酸。例如，R4顯著提高三肽-1（甘氨酰-組氨酰-賴氨酸，GHK）的滲透率［77］；R6連接免疫蛋白OVA應用到雄性小鼠皮膚上，增強了抗原特異性抗體的誘導［78］；TD-1與R8聯(lián)用可促進MITF-siRNA皮膚滲透，顯著抑制黑色素合成［79］；R9提高綠色熒光蛋白（GFP）和胰島素的皮膚滲透［55］；R11修飾的塞來昔布納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體比未修飾載體有更高的透皮效率［80］。此外，還有一些含有精氨酸殘基的肽具有皮膚促滲作用，如R5H3［46］、R8H3［81］等。 Ho等［82］發(fā)現(xiàn)TAT蛋白的47～57位殘基具有很強的α-螺旋特征，且表面上帶電的精氨酸殘基與其透皮轉(zhuǎn)導功能有著密切的關(guān)系，于是增強了該肽段的α-螺旋和精氨酸殘基特征得到了一種新的穿膜肽YARA（YARAAARQARA）。在相同濃度下，YARA的皮膚滲透量為TAT（47～57）的30倍以上，且YARA介導熱休克蛋白P20穿透皮膚的效果明顯優(yōu)于TAT（47～57）［51］。Morris等［40］利用細胞穿膜肽的兩親特性設(shè)計了嵌合肽Pep-1，Pep-1是第一個商業(yè)化的細胞穿膜肽，以Chariot?的商品名上市多年。該肽可將各種多肽和蛋白質(zhì)以完全生物活性的形式有效地輸送到幾個細胞系中，無需與載荷蛋白進行化學共價連接或使載荷蛋白發(fā)生變性。 Pep-1由富含色氨酸的疏水性氨基序列（KETWWETWWTEW）和富含賴氨酸親水性結(jié)構(gòu)域（KKKKV）以及分隔2個結(jié)構(gòu)域的間隔區(qū)（WSQP）組成。Pep-1可與肉毒桿菌神經(jīng)毒素結(jié)合進入小鼠皮膚，有效滲透到表皮和真皮［83］；Pep-1也可與超氧化物歧化酶（SOD）融合，轉(zhuǎn)導到皮膚組織中，實現(xiàn)對缺血性腦損傷的有效治療［84］。 Chang等［53］發(fā)現(xiàn)TD-1中環(huán)狀結(jié)構(gòu)是多肽經(jīng)皮促滲活性的關(guān)鍵，若環(huán)肽的二硫鍵打開則其經(jīng)皮促滲活性則完全消失。他們通過部分精氨酸或賴氨酸掃描法合成了一系列的陽離子環(huán)肽，其中用賴氨酸雙取代TD-1的N-5和N-6位得到的TD-34（ACSSKKSKHCG）顯示出良好的促滲活性。由于SPP容易被蛋白水解酶降解，近年來開發(fā)了多種增強SPP穩(wěn)定性的方法。其中最穩(wěn)定和可靠的方法是N-乙?；虲-酰胺化［85-86］。TDN（ACSSKKSKHCG-NH2）是在TD-1的C末端酰胺化修飾獲得的，TDN的穩(wěn)定性明顯高于TD-1［53］。 之后，Tian等［30］將TD-34的N-1和N-2氨基酸進行取代，且C末端進行酰胺化，合成線性肽DL-2（KWSSKKSKHCG-NH2）和環(huán)狀肽DLCC-2（KCSSKKSKHCG-NH2）在皮膚中能維持相對穩(wěn)定的有效SPP濃度，促進藥物的皮膚吸收?？偟脕碚f，人工設(shè)計合成的SPP具有高度可定制化、無天然限制和精確控制等優(yōu)點，使其在藥物遞送和生物醫(yī)學應用中具有巨大潛力。然而在實際研發(fā)過程中，需要克服成本高、設(shè)計復雜性以及潛在的生物相容性問題等限制和不足。 2 SPP的促滲機制SPP作為一種新型的皮膚促滲劑，目前其作用機制尚缺乏深入的研究。已有研究顯示，不同SPP的促滲機制均有所差異，但它們都與藥物穿透皮膚的途徑密切有關(guān)。因此，從作用于角質(zhì)層和作用于皮膚附屬器這2個方面來闡述SPP的促滲機制。 2.1 作用于角質(zhì)層SPP與角質(zhì)層中的脂質(zhì)相互作用是其主要促滲機制之一。這種相互作用會使脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導致皮膚通透性增加。比如，蛙皮素通過與角質(zhì)層中的膽固醇相互作用影響膽固醇代謝，導致皮膚屏障功能的紊亂，以及改變脂質(zhì)酰基鏈的構(gòu)象來破壞脂質(zhì)雙分子層的有序性，增加皮膚的通透性，從而促進物質(zhì)的滲透［56］。 類似地，T2肽通過改變脂質(zhì)?；湹臉?gòu)象破壞脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，從而增強親水性藥物在角質(zhì)層中的分配。T2肽中C末端的組氨酸對角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞是重要的，而且這種破壞具有pH值依賴性。在較低pH值下，組氨酸帶正電荷，與角質(zhì)層的陰離子脂質(zhì)相互作用，造成脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。研究顯示，使用丙氨酸替代T2肽中的C末端的組氨酸時，該肽失去了增強藥物滲透皮膚的能力。在pH值升高時，也未觀察到角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化［50］。 另外，TD-1、SPACE、DLP等SPP在C末端也含有組氨酸，這表明SPP中C末端組氨酸可能在SPP的破壞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［36］。Penetratin是通過疏水的色氨酸殘基嵌入疏水的脂質(zhì)區(qū)域，極性殘基與膜表面的親水性磷酸基團結(jié)合，形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，造成角質(zhì)層脂質(zhì)的六邊形對稱排列向無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變，使藥物更快地通過角質(zhì)層擴散并遞送更多的藥物［42］。 此外，一些SPP會引起角蛋白由β-折疊向α-螺旋轉(zhuǎn)變，擾亂角蛋白的二級結(jié)構(gòu)，促進藥物滲透進入皮膚。例如，SPACE通過氫鍵和弱靜電相互作用與角蛋白相互作用，使角蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促進藥物向角質(zhì)層分配，從而增強藥物透過皮膚屏障的能力［36］。在生理條件下，帶正電的聚精氨酸能夠與帶負電的角蛋白進行靜電結(jié)合，該結(jié)合涉及角蛋白的多個位點。盡管聚精氨酸對每個結(jié)合位點的親和力較低，但由于多價性增強了整體相互作用。這種相互作用導致了角蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，從而提高了藥物在皮膚上的滲透性［36］。此外，LP-12通過疏水作用、靜電相互作用以及少量氫鍵相互作用與角蛋白相結(jié)合，改變角蛋白的二級結(jié)構(gòu)［36］。在另1項研究中也發(fā)現(xiàn)?；仓?R9與角質(zhì)層中的角蛋白反應，改變其二級結(jié)構(gòu)，使藥物滲透角質(zhì)層［23］。 事實上，SPACE、DRTTLTN、Mape-9、蛙皮素等促滲肽既對細胞間脂質(zhì)產(chǎn)生影響，又改變了角蛋白的二級結(jié)構(gòu)［32，36-37，87］。SPP的促滲機制可能與其相對分子質(zhì)量存在一定的相關(guān)性，即當SPP的相對分子質(zhì)量小于1 000時，主要影響角質(zhì)細胞間脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，而相對分子質(zhì)量大于1 000時，SPP既影響角質(zhì)細胞間脂質(zhì)區(qū)域又改變角質(zhì)細胞中的角蛋白結(jié)構(gòu)［32］。 2.2 作用于皮膚附屬器對于一些離子型藥物或極性較強的大分子藥物，由于難以通過富含類脂的角質(zhì)層，因此經(jīng)皮膚附屬器途徑就成為其透過皮膚的主要途徑。Chen等［25］進行了作用時效研究，在糖尿病大鼠皮膚上預處理TD-1 5 min，洗去TD-1并等待一段時間后在同一位置涂抹胰島素。當?shù)却龝r間增加到15 min或更長時，胰島素的透皮效率大幅下降，皮膚切片結(jié)果顯示胰島素深入毛囊，表明TD-1可能短暫作用于毛囊，加快胰島素的皮膚吸收。毛囊漏斗部到下部中央/上部上鞘部區(qū)域密布著緊密連接，與Caco-2細胞單層具有類似的結(jié)構(gòu)［88］。 因此，Chang等［53，89］利用Caco-2細胞單層模型預測胰島素的皮膚吸收行為，研究發(fā)現(xiàn)TD-1、TD-34和TDN系列環(huán)肽可逆地降低Claudins-1（Claudins-1是緊密連接的主要組成蛋白之一，具有維持緊密連接屏障的功能）的免疫反應性，造成Claudin-1的表達失調(diào)，松開Caco-2細胞單層的緊密連接，致使膜屏障受損，從而增強胰島素的吸收。此外，IMT-P8、POD等一些SPP促進藥物進入皮膚后主要沉積在毛囊中，它們的促滲機制是否與毛囊有關(guān)仍有待進一步研究［34，90］?？偟膩碚f，SPP基于皮膚附屬器途徑的促滲機制研究尚處于起步階段。SPP在這個過程中有所作用，但具體的作用過程還未闡明，仍有很大的研究空間［91］。 3 SPP的應用及其方式目前關(guān)于SPP應用的研究報道較多，其中主要的應用方式包括4種：SPP與藥物的物理混合、SPP與藥物形成共價連接、SPP與蛋白類藥物形成融合蛋白、SPP修飾藥物載體，具體SPP的應用方式見表2。     
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