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導(dǎo)讀 近日，美國普林斯頓大學(xué)（Princeton University）Todd K. Hyster課題組報(bào)道了一種光酶催化烯烴的氫-胺化反應(yīng)，其通過Baeyer-Villiger單氧酶實(shí)現(xiàn)了一系列2,2-二取代吡咯烷的合成。作者通過五輪蛋白工程得到一個(gè)突變體，使得產(chǎn)物的產(chǎn)率和立體選擇性都非常出色。與依賴胺基或烯烴氧化構(gòu)建C-N鍵的相關(guān)光化學(xué)氫-胺化反應(yīng)不同，此轉(zhuǎn)化利用了還原生成的芐基自由基與氮原子的孤對(duì)電子之間的空間相互作用來構(gòu)建C-N鍵。這種獨(dú)特的C-N鍵構(gòu)建機(jī)理在小分子催化中是難以實(shí)現(xiàn)的，為化學(xué)合成中未解決的挑戰(zhàn)提供了獨(dú)特的解決方案。相關(guān)成果發(fā)表在Nature上，文章鏈接DOI：10.1038/s41586-024-08138-w。 
正文 由于氮原子普遍存在于小分子藥物和農(nóng)用化學(xué)品中，因此發(fā)展高效的碳氮鍵構(gòu)建方法在現(xiàn)代合成化學(xué)中至關(guān)重要。烯烴的氫-胺化是利用非活化烯烴構(gòu)建碳氮鍵的一種原子經(jīng)濟(jì)的合成策略。然而，在制備全取代的碳立體中心時(shí)，這些反應(yīng)很難實(shí)現(xiàn)不對(duì)稱反應(yīng)過程。最近，美國普林斯頓大學(xué)Todd K. Hyster課題組利用Baeyer-Villiger單氧酶實(shí)現(xiàn)了一種光酶催化烯烴的氫-胺化反應(yīng)，構(gòu)建了一系列2,2-二取代吡咯烷。通過五輪蛋白工程得到的蛋白突變體，可以以良好的產(chǎn)率和立體選擇性得到產(chǎn)物。機(jī)理方面，此轉(zhuǎn)化利用了還原生成的芐基自由基與氮原子的孤對(duì)電子之間的空間相互作用來構(gòu)建C-N鍵，這與傳統(tǒng)的利用胺基或烯烴氧化構(gòu)建C-N鍵有所不同（Figure 1）。歡迎下載化學(xué)加APP到手機(jī)桌面，合成化學(xué)產(chǎn)業(yè)資源聚合服務(wù)平臺(tái)。  （圖片來源：Nature） 首先，作者以帶有端烯的苯胺1為模板底物，探索了利用其構(gòu)建2,2-雙官能團(tuán)化吡咯烷的轉(zhuǎn)化（Figure 2）。通過對(duì)多種不同的黃素酶進(jìn)行篩選，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用AcCHMO（Acinetobacter calcoaceticus）時(shí)可以有效的實(shí)現(xiàn)5-exo-trig環(huán)化，以1%的產(chǎn)率，55:45 er得到吡咯烷產(chǎn)物2，且并沒有觀察到6-endo-trig產(chǎn)物3。而對(duì)于其它的酶，包括苯乙烯氧化酶、D-氨基酸氧化酶、單胺氧化酶、膽固醇氧化酶、氯氧化酶等均不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于利用蛋白質(zhì)工程可以有效改善反應(yīng)的產(chǎn)率和立體選擇性，因此作者利用軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將酶通過五輪蛋白工程得到一個(gè)突變體，其可以以97%的產(chǎn)率，95:5 er，選擇性的得到吡咯烷產(chǎn)物2。分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明R490E、I490T和A479H三個(gè)位點(diǎn)位于一個(gè)環(huán)狀區(qū)，是酶的活性位點(diǎn)。這種在遠(yuǎn)端位點(diǎn)突變的設(shè)計(jì)在打開催化活性位點(diǎn)和實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)與底物的接觸中起到至關(guān)重要的作用。隨后，作者測(cè)試了無細(xì)胞狀態(tài)下的酶催化活性。當(dāng)將催化劑的載量降為0.04 mol %時(shí)，仍可以以17 %的產(chǎn)率得到產(chǎn)物4（TON = 436），且立體選擇性得到保持。此外，作者還發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入1.0 equiv NADP+可以抑制反應(yīng)，因此其可以作為有效的抑制劑。 
（圖片來源：Nature） 在最優(yōu)反應(yīng)條件下，作者對(duì)此轉(zhuǎn)化的底物范圍進(jìn)行了考察（Figure 3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一系列不同取代的苯胺和苯乙烯均可良好兼容，以14-99%的產(chǎn)率得到相應(yīng)的產(chǎn)物2-26。其中，富電子芳烴通常提供更高的產(chǎn)率和選擇性(2、4-10、13-20)。苯胺一側(cè)（10）和苯乙烯部分（19）上的大取代基，如萘，可以在沒有降低產(chǎn)率和對(duì)映選擇性的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，缺電子的氮雜環(huán)同樣是耐受的（11-12, 21），其克服了Br?nsted酸催化環(huán)化的局限性。遺憾的是，環(huán)化反應(yīng)對(duì)雜環(huán)取代較敏感，反應(yīng)會(huì)受到影響。而利用蛋白質(zhì)工程可以克服這些限制。相應(yīng)的同系化底物可以實(shí)現(xiàn)6-exo-trig環(huán)化，以13%的產(chǎn)率得到產(chǎn)物22，并具有良好的對(duì)映選擇性（78:22 er）。這是一個(gè)有趣的例子，因?yàn)楫?dāng)使用光氧化還原催化劑時(shí)，這種類型的底物通常會(huì)經(jīng)歷1,5-HAT而非環(huán)化。 此外，利用此策略還可以以中等產(chǎn)率（42%）和對(duì)映體比（27:73）得到修飾的吡咯烷骨架23。接下來，作者利用此方法制備了三種芳基吡咯烷原料藥的α-甲基化類似物。包括TRK抑制劑GNF-862541的甲基化吡咯烷片段24（85%, 94:6 er）；改良的原肌球蛋白抑制劑片段α-甲基larorectinib 26（77%, 75:25）和其相關(guān)結(jié)構(gòu)25（25%, 73:27）。這些合成過程表明，利用此方法可以很容易的制備通常需要多步合成的取代類似物。 
（圖片來源：Nature） 接下來，作者對(duì)反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了探索（Figure 4）。作者發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)具有一定的誘導(dǎo)期，且不是由反應(yīng)物的氧化來啟動(dòng)反應(yīng)，誘導(dǎo)期的觀察表明氧化黃素不是自由基引發(fā)的原因，而是需要光還原才能發(fā)生反應(yīng)。而當(dāng)使用連二亞硫酸鈉還原酶進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，在沒有誘導(dǎo)期的情況下以74 %的產(chǎn)率，95:5 er得到產(chǎn)物。UV-Vis光譜表明，連二亞硫酸鈉還原酶與光照還原酶是等效的。因此，此反應(yīng)的誘導(dǎo)期是經(jīng)歷了光化學(xué)還原FAD為FADhq。此外，作者利用控制實(shí)驗(yàn)排除了能量轉(zhuǎn)移機(jī)理的可能?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，作者得出反應(yīng)首先經(jīng)歷了烯烴被FADhq*還原。由于FADhq*的E0為-2.26 V vs. SCE，因此其無法還原α-甲基苯乙烯（Ered = -2.6 V vs. SCE）。但是正電性的活性位點(diǎn)可以減小反應(yīng)物的還原電勢(shì)，而且可以穩(wěn)定FADsq-。這種陰離子具有很強(qiáng)的堿性，能夠快速且不可逆的脫質(zhì)子，從而形成芐基自由基。 
（圖片來源：Nature） 作者通過研究發(fā)現(xiàn)，芐基自由基和苯胺之間的相互作用會(huì)影響氧化還原過程，且這種作用關(guān)系在以往的報(bào)道中還未出現(xiàn)。由于氮原子的孤對(duì)電子和自由基之間的超共軛作用，可以有效增加SOMO軌道的能量，使自由基更容易被氧化。因此此轉(zhuǎn)化經(jīng)歷了一種與小分子催化完全不同的氫-胺基化機(jī)理。其利用芐基自由基與氮原子的孤對(duì)電子之間的空間相互作用來降低酶催化位點(diǎn)的自由基氧化還原電勢(shì)從而構(gòu)建C-N鍵。 
總結(jié) 文獻(xiàn)詳情： Emergence of a distinct mechanism of C–N bond formation in photoenzymes. Felix C. Raps, Ariadna Rivas-Souchet, Chey M. Jones, Todd K. Hyster*. Nature, 2024 https:///10.1038/s41586-024-08138-w. 
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