在生物醫(yī)學(xué)探索的前沿，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物因其與人類在進(jìn)化和生物學(xué)特征上的密切關(guān)聯(lián)而扮演著至關(guān)重要的角色，尤其是在干細(xì)胞生物學(xué)和基因編輯技術(shù)的研究領(lǐng)域。但始終面臨著一個(gè)核心難題：如何高效地利用胚胎干細(xì)胞（ESCs）來培育出具有顯著供體細(xì)胞比例的嵌合體動(dòng)物，這在推動(dòng)相關(guān)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展中至關(guān)重要。

華大DNBelab C4平臺(tái)具有捕獲效率高、數(shù)據(jù)分析豐富、平臺(tái)穩(wěn)定性優(yōu)秀等特點(diǎn)，深受研究者們的青睞。這篇去年發(fā)表于頂刊《Cell》上的研究，基于華大DNBelab C4平臺(tái)進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，幫助科學(xué)家詳細(xì)了解ESCs在嵌合體猴中的高功能性貢獻(xiàn)，并在單個(gè)細(xì)胞水平上理解細(xì)胞命運(yùn)決定和細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)化，為研究細(xì)胞分化提供了新的視角。

期刊：Cell

影響因子：45.5

發(fā)表時(shí)間：2023.11

樣本類型：食蟹猴胚胎干細(xì)胞

DOI: 10.1016/j.cell.2023.10.005

哺乳動(dòng)物的多能干細(xì)胞展現(xiàn)出類似于胚胎發(fā)育早期階段的多能性，這種特性在嚙齒類動(dòng)物中已經(jīng)得到了證實(shí)。然而，由于供體細(xì)胞與宿主胚胎的發(fā)育階段不同步，導(dǎo)致這種多能性在其他物種，包括非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，難以實(shí)現(xiàn)有效的嵌合。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、采用人類PSC培養(yǎng)方案捕獲食蟹猴類內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多能性

構(gòu)建了六種不同培養(yǎng)基條件下的食蟹猴胚胎干細(xì)胞，并對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，4CL培養(yǎng)體系下的細(xì)胞保持了良好的傳代穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性（圖1 A-C）。通過特定的培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)了食蟹猴ESCs與體內(nèi)胚胎在基因表達(dá)和DNA甲基化水平上的相似性（圖1 D-G）。

2、利用na?ve態(tài) ESC產(chǎn)生嵌合早期猴胚胎的優(yōu)化程序

選用綠色熒光蛋白標(biāo)記的4CL條件下的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行猴胚胎注射實(shí)驗(yàn)，通過測(cè)試和優(yōu)化胚胎干細(xì)胞注射入受體胚胎后的不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間的組合，最終確定了平衡ESC存活和囊胚發(fā)育的最佳培養(yǎng)條件（圖2 A-D）。

3、長(zhǎng)期培養(yǎng)中ESC對(duì)胚胎的整體貢獻(xiàn)

在受精后第15至17天時(shí)出現(xiàn)了明顯的胚胎盤狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)在4CL胚胎中觀察到了大量的GFP細(xì)胞（圖3 A-D）。對(duì)4CL胚胎細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定得到了6個(gè)細(xì)胞簇，并且證實(shí)了ESCs在嵌合體發(fā)育中對(duì)胚胎的貢獻(xiàn)（圖3 E-G）。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞簇進(jìn)行了GO富集分析確定了不同細(xì)胞簇的主要功能（圖3 J）。

4、同源ESC產(chǎn)生的高貢獻(xiàn)度嵌合猴

通過將嵌合猴胚胎移植到代孕雌性猴中獲得活產(chǎn)嵌合猴，PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)活產(chǎn)嵌合猴的幾乎所有組織中都有較強(qiáng)的GFP序列信號(hào)，并且ESCs在活產(chǎn)嵌合猴不同組織中的貢獻(xiàn)比例達(dá)到了67%（圖4 A-D）。熒光成像和FACS分析結(jié)果表明檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活產(chǎn)嵌合猴的骨髓細(xì)胞（BMC）和外周血單核細(xì)胞（PBMC）中均存在較強(qiáng)信號(hào)，且GFP細(xì)胞占比較高（圖4 E-F）。在另外9個(gè)組織中也觀察到了較強(qiáng)的GFP熒光信號(hào)（圖4 G-I）。對(duì) GFP 和 NeuN 進(jìn)行共染色進(jìn)一步證實(shí)ESCs衍生的細(xì)胞能夠分化為功能性的神經(jīng)細(xì)胞（圖4 J）。免疫染色發(fā)現(xiàn)ESCs在嵌合體猴多個(gè)組織以及大腦皮層中均有顯著貢獻(xiàn)和分化能力（圖4 K-L）。

5、嵌合猴中胚胎干細(xì)胞多功能性

對(duì)活產(chǎn)嵌合猴進(jìn)行了Smart-seq 2測(cè)序并根據(jù)標(biāo)記基因表達(dá)鑒定出了10種細(xì)胞類型，其中GFP細(xì)胞對(duì)這些細(xì)胞均有一定程度的貢獻(xiàn)（圖6 A-D）。進(jìn)一步通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序增加了測(cè)序得到了細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嵌合體胚胎在發(fā)育過程中存在潛在的分化偏差（圖6 E-G）。對(duì)腦組織應(yīng)用了同樣的分析方法，揭示了這些細(xì)胞在神經(jīng)發(fā)育中的多樣化貢獻(xiàn)以及GFP細(xì)胞的類型和狀態(tài)（圖6 H-N）。

6、ESC對(duì)嵌合猴生殖細(xì)胞和胎盤的貢獻(xiàn)

通過免疫熒光檢測(cè)證實(shí)了供體ESC在活體嵌合猴體內(nèi)分化為了生殖細(xì)胞，且貢獻(xiàn)比例高達(dá)70%左右（圖6 A-B）。對(duì)活產(chǎn)嵌合猴的睪丸細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。分析結(jié)果顯示ESCs能夠在嵌合體猴的睪丸中分化為多種類型的細(xì)胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞傾向于表達(dá)與卵巢相關(guān)的基因（圖6 C-G）。同時(shí)還證實(shí)了ESCs具有分化為胎盤細(xì)胞的能力（圖6 H）。

7、嵌合猴胚胎干細(xì)胞衍生細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)和基因組完整性

通過比較活體嵌合猴的GFP陽性和GFP陰性成纖維細(xì)胞的DNA甲基化水平發(fā)現(xiàn)活體嵌合猴中GFP陽性細(xì)胞表現(xiàn)出較高的甲基化水平（圖7 I-J）。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示GFP陽性和GFP陰性細(xì)胞在基因表達(dá)和DNA甲基化水平上具有高度相似性（圖7 K-L）。全基因組測(cè)序（WGS）發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞相對(duì)于GFP陰性細(xì)胞顯示出較少的基因組異常（圖7 M）。

研究結(jié)論

本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和胚胎注射技術(shù)，成功培育出具有高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的活體嵌合體猴，并通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析深入揭示了其在多種組織包括生殖細(xì)胞和胎盤中的功能性貢獻(xiàn)，證實(shí)胚胎干細(xì)胞能高效地分化為胎盤組織和生殖細(xì)胞,為利用基因編輯技術(shù)在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中創(chuàng)建復(fù)雜遺傳模型提供了新途徑。本研究成果以封面文章的形式在《Cell》上發(fā)表。首次這一突破對(duì)深入理解靈長(zhǎng)類動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的全能性具有重大意義，并且為創(chuàng)建遺傳修飾的模型猴提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

基于華大DNBelab C4平臺(tái)的單細(xì)胞測(cè)序和其他實(shí)驗(yàn)的聯(lián)合分析研究，不僅能夠更深入地理解ESCs在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的分化潛力，同時(shí)還能夠探索它們?cè)谙嚓P(guān)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的無限可能。

凌恩生物擁有豐富的動(dòng)物單細(xì)胞（核）轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)！基于華大DNBelab C4平臺(tái)單細(xì)胞平臺(tái)，目前已應(yīng)用于超過50個(gè)物種的300多個(gè)組織類型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究。性比價(jià)高、成本低，適合大樣本量研究，感興趣的小伙伴抓緊聯(lián)系我們哦！

參考文獻(xiàn)

Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells. Cell. 2023 Nov 9;186(23):4996-5014.e24.