大家好,這里是專注表觀組學(xué)十余年,領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。 TGF-β超家族包括TGFβ、Activin、Nodal、BMPs等,通過受體絲氨酸/蘇氨酸激酶傳遞信號(hào),對(duì)細(xì)胞生長、分化、組織再生和癌變至關(guān)重要。Smad2和Smad3(Smad2/3)在TGFβ激活后被磷酸化,形成三聚體,可以與共同介質(zhì)Smad4結(jié)合或不結(jié)合。Smad4與Smad2和Smad3(Smad2/3)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體在典型的TGFβ信號(hào)通路中至關(guān)重要,但并非所有響應(yīng)都必需,不依賴Smad4為共同介質(zhì)的Smad2/3作用仍研究不足。因此研究Smad2/3在獨(dú)立于Smad4情況下如何調(diào)控mESCs譜系起始和分化,并探索這一過程中的分子機(jī)制尤為重要。 近日,上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王瓊研究員、Yanhua Du和生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院章永春團(tuán)隊(duì)合作,共同探討了TGFβ-Smad信號(hào)通路和DNA甲基化在調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)從原始態(tài)多能性(na?ve pluripotency)向始發(fā)態(tài)多能性(primed pluripotency)轉(zhuǎn)變以及隨后的分化過程中的作用。相關(guān)研究成果以“A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to-primed pluripotency and differentiation”為題發(fā)表在Nature子刊《Nature Communications》上。 標(biāo)題:A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to-primed pluripotency and differentiation(TGFβ-SMAD信號(hào)通路和DNA甲基化模式調(diào)控原始態(tài)到始發(fā)態(tài)多能性轉(zhuǎn)換和分化) 期刊:Nature Communications 影響因子:IF 14.7 應(yīng)用技術(shù):RNA-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq(易基因金牌技術(shù)) 本研究引入了一個(gè)逐步模式,其中Smad2/3通過與不同效應(yīng)因子合作來調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)的譜系啟動(dòng)和分化。在從原始態(tài)多能性向始發(fā)態(tài)多能性轉(zhuǎn)變的過程中,Smad2/3上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(Dnmt3b),建立了適當(dāng)?shù)腄NA甲基化模式,進(jìn)而使Smad2/3能夠結(jié)合到外胚層標(biāo)記基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的低甲基化區(qū)域。因此,在Smad2/3缺失情況下,Smad4單獨(dú)不能啟動(dòng)外胚層特異性基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)始發(fā)態(tài)外胚層細(xì)胞開始分化時(shí),Dnmt3b在全基因組甲基化中的活躍度降低,Smad4與Smad2/3形成復(fù)合物以支持中胚層和內(nèi)胚層誘導(dǎo)。因此,缺乏Smad4的mESCs可以經(jīng)歷啟動(dòng)過程,但在下游分化中遇到困難。本研究揭示了TGFβ信號(hào)及其在細(xì)胞過程中作用的復(fù)雜機(jī)制。 研究方法
結(jié)果圖形(1)S2/3DKO 和 S4KO的的差異轉(zhuǎn)錄組分析圖1:mESC分化過程中Smad2/3和Smad4的差異需求。
(2)在Smad4缺失情況下,外胚層(Epiblast)可以形成圖2:Smad4缺失情況下的外胚層形成。
(3)Dnmt3b與Smad2/3互作圖3:Dnmt3b與Smad2/3互作。
(4)Smad2/3上調(diào)Dnmt3b對(duì)外胚層形成至關(guān)重要圖4:Smad2/3上調(diào)Dnmt3b對(duì)外胚層形成非常重要。
(5)Dnmt3b獨(dú)立于Smad4介導(dǎo)Smad2/3與外胚層基因結(jié)合。圖5:Dnmt3b獨(dú)立于Smad4介導(dǎo)Smad2/3與外胚層基因結(jié)合。
B 在Dnmt3b-Flag EBs中68204個(gè)Dnmt3b結(jié)合位點(diǎn)±1.5 kb基因組區(qū)域內(nèi)Flag CUT&Tag的標(biāo)簽密度熱圖,以及在WT或S4KO中32717或11080個(gè)Smad2/3結(jié)合位點(diǎn)中心的Smad2/3 ChIP-seq。 C. S4KO和S4KO+3b-sh2的EBs中Smad2/3 CUT&Tag的基因軌跡視圖,靶向Fgf5、Dnmt3a和Dnmt3b位點(diǎn)。 D. 在S4KO和S4KO+3bsh2周圍7926個(gè)Smad4獨(dú)立的Smad2/3峰值的Smad2/3 CUT&Tag信號(hào)熱圖。 E. Dnmt3b依賴的Smad2/3結(jié)合位點(diǎn)峰值得分圖。標(biāo)記了與峰值相鄰的外胚層標(biāo)記基因。 F. 對(duì)WT、S2/3KO、S4KO+Scr-shRNA、S4KO+3b-Sh1或S4KO+3b-sh2細(xì)胞系的D3 EBs中Fgf5啟動(dòng)子(Fgf5_PP)、基因體(Fgf5_GB)和增強(qiáng)子(Fgf5_+30k、Fgf5_+40k和Fgf5_+56k)的Smad2/3和Dnmt3b結(jié)合進(jìn)行ChIP-qPCR分析。使用抗IgG的ChIP作為陰性對(duì)照。 易小結(jié)本研究通過RNA-seq、ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq、WGBS等分析揭示了Smad2/3在mESCs向EpiLCs轉(zhuǎn)變過程中通過誘導(dǎo)Dnmt3b表達(dá)來調(diào)控DNA甲基化模式,從而促進(jìn)原始態(tài)多能性向始發(fā)態(tài)多能性的轉(zhuǎn)變。同時(shí)還揭示了在Smad2/3缺失情況下,Smad4單獨(dú)不能啟動(dòng)Epiblast特異性基因轉(zhuǎn)錄。在分化過程中,Dnmt3b活性降低,Smad4與Smad2/3形成復(fù)合物,支持中胚層和內(nèi)胚層的誘導(dǎo)。 總之,本研究闡明了TGFβ信號(hào)通路在細(xì)胞過程中的復(fù)雜機(jī)制,特別是Smad2/3和Smad4在mESCs的原始態(tài)多能性向始發(fā)態(tài)多能性轉(zhuǎn)變以及隨后分化中的作用,提出了一個(gè)逐步調(diào)控模型。 關(guān)于易基因染色質(zhì)免疫共沉淀測序 (ChIP-seq)染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP),是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典方法。將ChIP與高通量測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù),可在全基因組范圍對(duì)特定蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行高效而準(zhǔn)確的篩選與鑒定,為研究的深入開展打下基礎(chǔ)。 DNA與蛋白質(zhì)的相互作用與基因的轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)的空間構(gòu)型和構(gòu)象密切相關(guān)。運(yùn)用組蛋白特定修飾的特異性抗體或DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子特異性抗體富集與其結(jié)合的DNA片段,并進(jìn)行純化和文庫構(gòu)建,然后進(jìn)行高通量測序,通過將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組精確比對(duì),研究人員可獲得全基因組范圍內(nèi)某種修飾類型的特定組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子與基因組DNA序列之間的關(guān)系,也可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行差異比較。 應(yīng)用方向: ChIP 用來在空間上和時(shí)間上不同蛋白沿基因或基因組定位
技術(shù)優(yōu)勢:
技術(shù)路線: 關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序(WGBS) 全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序(WGBS)可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個(gè)胞嘧啶堿基(C堿基)的甲基化水平,是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時(shí)空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持,能廣泛應(yīng)用在個(gè)體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機(jī)制研究中,也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。 易基因全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶,在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列,連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏,進(jìn)而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。 應(yīng)用方向: WGBS廣泛用于各種物種,要求全基因組掃描(不錯(cuò)過關(guān)鍵位點(diǎn))
技術(shù)優(yōu)勢:
易基因染色質(zhì)可及性-轉(zhuǎn)座酶易接近染色質(zhì)測序(ATAC-seq) ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)是通過使用高通量測序?qū)D(zhuǎn)座酶可接近性核染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行分析的一種創(chuàng)新表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)。該技術(shù)通過轉(zhuǎn)座酶對(duì)某種特定時(shí)空下開放的核染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行切割,進(jìn)而獲得在該特定時(shí)空下基因組中所有活躍轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。 真核生物的DNA并不是裸露的,而是被包裝成核小體形成串珠狀結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步被折疊、包裝。而基因的轉(zhuǎn)錄,需要將這種高級(jí)結(jié)構(gòu)解開,使DNA成為可以使各種轉(zhuǎn)錄機(jī)器與其結(jié)合的裸露狀態(tài),即形成開放染色質(zhì)區(qū)域。如何鑒定開放染色質(zhì)區(qū)域呢?傳統(tǒng)的方法主要是借助和DNase-Seq、MNase-Seq及ChIP-seq。但這些方法需要的起始細(xì)胞量較大,對(duì)于少量樣本和珍稀樣本可行性不高。ATAC-Seq是一種新型的研究開放染色質(zhì)的技術(shù),利用Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)入并切割裸露的DNA,并同時(shí)連接上特異性的測序接頭。因?yàn)榍懈詈图咏宇^一步完成,因此該技術(shù)可大大降低所需細(xì)胞起始量。 技術(shù)優(yōu)勢: (1)所需細(xì)胞起始量低。 (2)應(yīng)用范圍廣,適用于大部分物種及細(xì)胞類型。 實(shí)驗(yàn)策略: 信息分析: 易基因提供全面的表觀基因組學(xué)(DNA甲基化、DNA羥甲基化)和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)(m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能組學(xué)技術(shù)方案(ChIP-seq、ATAC-seq),詳詢易基因:0755-28317900。 參考文獻(xiàn): Zhao B, Yu X, Shi J, Ma S, Li S, Shi H, Xia S, Ye Y, Zhang Y, Du Y, Wang Q. A stepwise mode of TGFβ-SMAD signaling and DNA methylation regulates na?ve-to-primed pluripotency and differentiation. Nat Commun. 2024 Nov 22;15(1):10123. pii: 10.1038/s41467-024-54433-5. doi: 10.1038/s41467-024-54433-5. PubMed PMID: 39578449. 相關(guān)閱讀: 項(xiàng)目文章 | WGBS+RNA-seq揭示松材線蟲JIII階段形成過程中的DNA甲基化差異 項(xiàng)目文章 | WGBS+RNA-seq揭示黃瓜作物的“源-庫”關(guān)系受DNA甲基化調(diào)控 項(xiàng)目文章 | Nat Commun:中南大學(xué)曾朝陽/熊煒/龔朝建團(tuán)隊(duì)利用ChIP-seq等揭示頭頸鱗癌免疫逃逸機(jī)制 項(xiàng)目文章 | Nature子刊:ChIP-seq等揭示c-di-AMP與DasR互作以調(diào)控細(xì)菌生長、發(fā)育和抗生素合成 |
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