目前，化療耐藥仍是PDAC治療面臨的最大挑戰(zhàn)。近年來，AG已被推薦為PDAC2的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而，由于耐藥的原因，對(duì)AG的反應(yīng)并不令人滿意。因此，探索PDAC的潛在治療因子以克服化療耐藥是迫切需要的。多項(xiàng)研究表明AVL9可促進(jìn)多種腫瘤的進(jìn)展，但AVL9在PDAC中的作用尚未被探索。在這里，研究人員研究了AVL9在胰腺癌化療耐藥中的作用。發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧微環(huán)境導(dǎo)致AVL9表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)IκBα的降解和NF-κB的異常激活，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。此外，通過篩選抑制劑，為消除AG的化療耐藥性提供了一種有前景的靶向AVL9的藥物。

研究人員使用了類器官模型、患者來源的異種移植（PDX）和基因工程小鼠模型，采用染色質(zhì)免疫共沉淀、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀和western blot分析探討其作用機(jī)制。通過蛋白結(jié)構(gòu)分析和分子對(duì)接分析鑒定AVL9抑制劑，并在PDX、PDOX和KPC模型中驗(yàn)證其療效。通過多策略篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)AVL9是PDAC中AG耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在機(jī)制上，缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α驅(qū)動(dòng)AVL9的表達(dá)，AVL9可作為支架促進(jìn)IκBα與SKP1結(jié)合，增強(qiáng)IκBα的泛素化和降解，進(jìn)一步激活NF-κB通路。潛在的AVL9靶向抑制劑Edotecarin被證明可以逆轉(zhuǎn)PDAC中的AG化療耐藥性。在PDAC中，AVL9的表達(dá)由HIF1α驅(qū)動(dòng)。AVL9、IκBα和SKP1的物理相互作用為NF-κB通路的異常激活提供了新的分子機(jī)制。

研究人員收集了腫瘤和癌旁組織，檢測(cè)AVL9在PDAC中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AVL9在腫瘤中過表達(dá)，并且在64對(duì)腫瘤中有較高水平，這被TCGA數(shù)據(jù)證實(shí)。此外，AVL9低表達(dá)患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期較長(zhǎng)。在兩個(gè)隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，AVL9高表達(dá)與接受AG方案新輔助化療的患者早期肝轉(zhuǎn)移和無進(jìn)展生存期下降相關(guān)。此外，與AVL9-low組相比，AG在AVL9-high組中的IC50值顯著較高。研究人員使用隨機(jī)選取的6例患者的手術(shù)腫瘤組織構(gòu)建PDX模型，根據(jù)AVL9的表達(dá)水平將其分為兩組，發(fā)現(xiàn)與AVL9-low組相比，AVL9-high組的腫瘤重量抑制顯著降低（圖2）。結(jié)果表明AVL9的高表達(dá)與PDAC患者的不良預(yù)后和化療耐藥相關(guān)。

通過評(píng)估AVL9在原代細(xì)胞系中的表達(dá)和創(chuàng)建穩(wěn)定細(xì)胞系，研究人員在低、中表達(dá)水平的細(xì)胞系中過表達(dá)AVL9，在中、高表達(dá)水平的細(xì)胞系中下調(diào)AVL9的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AVL9增加了AG的IC50，而敲除AVL9則降低了該值。在AG缺失的情況下，AVL9的異位表達(dá)不影響腫瘤細(xì)胞的增殖或凋亡。然而，在AG處理過程中，它降低了細(xì)胞凋亡率，而敲低AVL9導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。AVL9在正常條件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響最小，但在AG治療期間提高了細(xì)胞存活率。在正常條件下，AVL9不改變DNA損傷或凋亡相關(guān)蛋白，但在AG處理下敲低AVL9導(dǎo)致γ-H2X和Cleaved-Caspase3水平升高。為了進(jìn)一步研究AVL9是否可以解釋PDAC在體內(nèi)的化療反應(yīng)，研究人員構(gòu)建了KPC小鼠AVL9純合缺失（KPCA）。出生2個(gè)月后，將KPC和KPCA小鼠隨機(jī)分為兩組：vehicle組和AG組。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AG處理后，KPCA的腫瘤負(fù)荷明顯低于KPC。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)經(jīng)AG處理后，KPCA小鼠中cleaved-caspase3標(biāo)記的腫瘤凋亡顯著增加。在一項(xiàng)平行的生存試驗(yàn)中，研究人員在接受AG治療的KPCA小鼠中觀察到顯著的生存獲益（圖3）。綜上所述，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腫瘤AVL9促進(jìn)了PDAC的化療耐藥。

研究人員對(duì)4例患者的新鮮腫瘤組織進(jìn)行了scRNA-seq，分析了24,410個(gè)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HIF1α的特異性表達(dá)與AVL9的陽性相關(guān)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AVL9和HIF1α mRNA水平之間存在強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，并且在腫瘤組織中存在正的IHC相關(guān)性。低氧條件下HIF-1α和AVL9的mRNA和蛋白水平均升高。用HIF-1α抑制劑KC7F2處理后，AVL9的表達(dá)顯著降低。計(jì)算分析顯示在AVL9啟動(dòng)子處有一個(gè)強(qiáng)有力的缺氧反應(yīng)元件（HRE）。染色質(zhì)pull-down實(shí)驗(yàn)顯示HIF-1α與AVL9啟動(dòng)子結(jié)合。熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)HIF1-1α增加了AVL9啟動(dòng)子的活性。因此，在PDAC中，以其在缺氧中的作用而聞名的HIF-1α很可能調(diào)節(jié)了AVL9的表達(dá)。分析胰腺導(dǎo)管腺癌組織中AVL9的表達(dá)和乳酸水平，以確定乳酸對(duì)AVL9表達(dá)的影響，結(jié)果顯示AVL9評(píng)分與乳酸含量呈正相關(guān)。在癌細(xì)胞培養(yǎng)物中添加25 mM乳酸，隨著時(shí)間的推移，AVL9 mRNA水平增加，并提高總泛乳糖基賴氨酸（Kla）的表達(dá)。研究人員還研究了組蛋白的乳糖化是否促進(jìn)AVL9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乳酸處理增加了AVL9和H3K18la的水平。靶向乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑AR-C155858顯著降低了AVL9和H3K18la的表達(dá)?？笻3K18la抗體的ChIP顯示，H3K18la在AVL9啟動(dòng)子區(qū)域富集（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明，TME中缺氧相關(guān)的乳酸蓄積通過H3K18la誘導(dǎo)AVL9表達(dá)。

為了研究AVL9如何增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的化療耐藥性，研究人員對(duì)PDX-vector/AVL9-OE細(xì)胞系進(jìn)行了RNA-seq和GSEA分析。值得注意的是，NF-κB信號(hào)通路在AVL9-OE細(xì)胞中高度富集，AVL9過表達(dá)可增強(qiáng)P65的核轉(zhuǎn)位，但不影響IKKβ、IκBα或P65的磷酸化。此外，AVL9在不影響IκBα mRNA水平的情況下降低了IκBα蛋白水平，表明在翻譯調(diào)節(jié)中起作用。CHX處理證實(shí)AVL9促進(jìn)IκBα降解，MG132處理逆轉(zhuǎn)了AVL9對(duì)IκBα穩(wěn)定性的影響。AVL9還增加了IκBα泛素化水平，IκBα-KO實(shí)驗(yàn)表明，AVL9可以抵消AVL9的化療耐藥效應(yīng)（圖5）。綜上所述，AVL9通過促進(jìn)IκBα泛素化和促進(jìn)P65核轉(zhuǎn)位增加PDAC的化療耐藥性。

考慮到AVL9-SKP1復(fù)合體在PDAC化療耐藥中的重要作用，通過分子對(duì)接分析篩選干擾AVL9與SKP1相互作用的潛在抑制劑。AVL9和SKP1相互作用位點(diǎn)的幾個(gè)候選配體被確定。其中，拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑Edotecarin的親和力得分最高。免疫共沉淀驗(yàn)證了Edotecarin可以顯著取消SKP1和AVL9之間的物理相互作用。接下來，研究人員使用SynergyFinder2.0在PDO模型中分析了Edotecarin和GEM的聯(lián)合作用。Edotecarin與GEM的綜合協(xié)同評(píng)分表明，在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，Edotecarin和GEM表現(xiàn)出協(xié)同的細(xì)胞毒性作用。此外，AG聯(lián)合Edotecarin可以明顯誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志物（Caspase3/7）的表達(dá)。與KPCAVL9-WT組相比，AG能顯著抑制KPCAVL9-KO組的胰腺腫瘤負(fù)荷，而Edotecarin能顯著消除這種差異。胰腺腫瘤的Cleaved-Caspase3染色也顯示了類似的結(jié)果。在平行生存試驗(yàn)中，KPCAVL9-KO組可以從AG中獲得比KPCAVL9-WT組更多的生存獲益，而KPCAVL9-KO組在AG+ Edotecarin處理后未能獲得更長(zhǎng)的生存時(shí)間。在體內(nèi)，研究人員使用了幾種臨床前小鼠模型，包括PDOX、PDX和KPC。將熒光素酶標(biāo)記的PDO原位移植到裸鼠體內(nèi)，并隨機(jī)分為4組。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與單藥治療相比，聯(lián)合治療顯著降低了腫瘤負(fù)荷。此外，Edotecarin和AG的聯(lián)合使用導(dǎo)致了更高的腫瘤細(xì)胞凋亡率。更重要的是，聯(lián)合用藥組患者的生存時(shí)間更長(zhǎng)（圖7）。以上證據(jù)表明，在臨床前小鼠模型中，Edotecarin可使PDAC對(duì)AG增敏。

該研究證實(shí)了AVL9為胰腺癌化療反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，機(jī)制方面，研究人員發(fā)現(xiàn)NF-κB通路與AVL9的表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證明AVL9可通過促進(jìn)P65核轉(zhuǎn)位和激活NF-κB通路誘導(dǎo)AG耐藥，而IκBα的降解是P65核轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵步驟。此外，AVL9依賴于SKP1促進(jìn)IκBα降解。分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn)，Edotecarin可干擾AVL9與SKP1的相互作用，從而增加PDAC對(duì)AG方案的敏感性。