|
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。 N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA中最普遍和豐富的修飾，通過“writer”（甲基轉(zhuǎn)移酶）、“eraser”（去甲基化酶）和“reader”（閱讀蛋白）動(dòng)態(tài)調(diào)控mRNA代謝的幾乎每一步，并干擾多種生物過程。RNA甲基化是調(diào)控免疫細(xì)胞功能的重要過程，但其如何影響CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤活性尚不完全清楚。 近日，澳門大學(xué)侯嘉杰教授和中山大學(xué)徐瑞華教授團(tuán)隊(duì)合作研究了m6A RNA reader蛋白YTHDF2在CD8 T細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)和亞細(xì)胞定位如何決定其在抗腫瘤免疫中的多功能性。研究發(fā)現(xiàn)YTHDF2在早期效應(yīng)T細(xì)胞或效應(yīng)樣CD8 T細(xì)胞中高表達(dá)，并且對(duì)腫瘤進(jìn)展和抗PD-1阻斷治療反應(yīng)有重要作用。相關(guān)研究成果以“YTHDF2 upregulation and subcellular localization dictate CD8 T cell polyfunctionality in anti-tumor immunity”為題發(fā)表在Nature子刊《Nature Communications》上。
標(biāo)題：YTHDF2 upregulation and subcellular localization dictate CD8 T cell polyfunctionality in anti-tumor immunity（YTHDF2上調(diào)和亞細(xì)胞定位決定CD8 T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的多功能性） 期刊：Nature Communications 發(fā)表時(shí)間：2024年11月5日 技術(shù)平臺(tái)：m6A-seq、RIP-seq、RNA-seq、ATAC-seq等（易基因金牌技術(shù)） 本研究首先揭示了m6A RNA reader蛋白YTHDF2在早期效應(yīng)或效應(yīng)樣CD8 T細(xì)胞中高表達(dá)。分析結(jié)果表明YTHDF2促進(jìn)了新生RNA（nascent RNA）合成，而m6A識(shí)別對(duì)于蛋白質(zhì)特異性核功能至關(guān)重要，也加強(qiáng)了其在RNA水平上的自我調(diào)控。T細(xì)胞中YTHDF2缺失會(huì)加劇腫瘤進(jìn)展，并導(dǎo)致對(duì)PD-1阻斷在小鼠和人類中的無反應(yīng)性。除了啟動(dòng)對(duì)線粒體健康必要的RNA衰變外，YTHDF2還協(xié)調(diào)染色質(zhì)變化，促進(jìn)T細(xì)胞的多功能性。YTHDF2與IKZF1/3互作，促進(jìn)目標(biāo)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。因此，在YTHDF2缺失T細(xì)胞中，通過聯(lián)合使用IKZF1/3抑制劑來那度胺（lenalidomide），可以大幅恢復(fù)免疫療法誘導(dǎo)的療效，該療效在小鼠模型中得到驗(yàn)證?？傊?，本研究結(jié)果表明YTHDF2協(xié)調(diào)表觀轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，以增強(qiáng)T細(xì)胞免疫，這可能為癌癥免疫治療提供新策略。 研究思路：
實(shí)驗(yàn)方法：樣本選擇：
技術(shù)平臺(tái)：
結(jié)果圖形：（1）YTHDF2在早期效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）和類效應(yīng)T細(xì)胞中選擇性上調(diào)和重新分布。
圖1：YTHDF2在早期Teff和類Teff細(xì)胞中選擇性上調(diào)和重新分布。 a. 不同時(shí)間點(diǎn)激活或向耗竭/記憶階段分化的人CD8 T細(xì)胞中m6A修飾物的mRNA表達(dá)（GSE212357）。 b. 接受抗PD-1或cIg治療的小鼠肺腫瘤中的CD8 T細(xì)胞中m6A修飾物的mRNA表達(dá)（GSE114300）。 c. 在體外生成的效應(yīng)CD8 T細(xì)胞（Teff，n=5個(gè)獨(dú)立樣本）和耗竭CD8 T細(xì)胞（Tex，n=5個(gè)獨(dú)立樣本）中YTHDF2的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。 d-e. 在接種B16F10-OVA腫瘤的小鼠的脾臟或腫瘤浸潤性T細(xì)胞亞群中YTHDF2的MFI，在腫瘤接種后第6天（n=5只小鼠）或第13天（n=5只小鼠）。 Tpex：祖細(xì)胞耗竭T細(xì)胞。Tmem：記憶T細(xì)胞。 f. 在接受抗PD-1或cIg治療的B16F10-OVA腫瘤中的CD8 T細(xì)胞亞群中YTHDF2的MFI（每組n=5只小鼠）。 g. 刺激的小鼠或人類CD8 T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中YTHDF2的免疫印跡分析。 h. na?ve或激活的CD8 T細(xì)胞中YTHDF2（紅色）和DAPI（藍(lán)色）的代表性共聚焦免疫熒光圖像。 i. 在進(jìn)展（n=5個(gè)獨(dú)立樣本）或縮?。╪=5個(gè)獨(dú)立樣本）的B16-OVA腫瘤中CD8（紅色）和YTHDF2（綠色）的代表性免疫熒光染色。 j. 在接受抗PD-1或cIg治療的CD8 Tpex細(xì)胞中YTHDF2（紅色）和DAPI（藍(lán)色）的代表性共聚焦免疫熒光圖像（每組n=6個(gè)獨(dú)立樣本）。 （2）YTHDF2 對(duì) CD8 T 細(xì)胞的抗腫瘤作用至關(guān)重要
圖2：YTHDF2對(duì)CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)至關(guān)重要。 a. 雄性Ythdf2F/F（n=6）或Ythdf2CKO（n=6）小鼠皮下注射10^6 Hepa1-6細(xì)胞。 b. 雌性Ythdf2F/F（n=7）或Ythdf2CKO（n=5）小鼠皮下注射5×10^5 B16F10細(xì)胞。 c. 雌性Ythdf2F/F（n=5）或Ythdf2CKO（n=5）小鼠皮下注射10^6 MC38細(xì)胞。每2或3天監(jiān)測(cè)一次腫瘤生長(zhǎng)。 d-f. 從接種MC38腫瘤的Ythdf2F/F（n=6）和Ythdf2CKO（n=6）小鼠中分離出的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TIL），在腫瘤接種后第12天，通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估TIL中T細(xì)胞亞群（CD8、CD4和調(diào)節(jié)性（Treg）T細(xì)胞）的數(shù)量（d），以及CD8 T細(xì)胞亞群中CD44+、KLRG1+陽性（e）、活化caspase-3（Casp-3）、顆粒酶B（Gzm B）、干擾素-γ（IFN-γ）或Ki-67陽性的頻率（f）。 g. 從攜帶MC38腫瘤的Ythdf2F/F（n=6）和Ythdf2CKO（n=6）小鼠（第18天）中，通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估PD-1+TIM3+CD101+的CD8 T細(xì)胞亞群頻率。 h. 將雌性Ythdf2F/F;OT-1（n=8）或Ythdf2CKO;OT-1（n=6）小鼠皮下注射10^6 B16F10-OVA細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。 i. 采用PBS對(duì)照或OVA預(yù)激活的Ythdf2F/F;OT-1或Ythdf2CKO;OT-1 CD8 T細(xì)胞進(jìn)行過繼轉(zhuǎn)移處理B16F10-OVA黑色素瘤（每組5只小鼠）。 j-k. 雌性Ythdf2F/F（n=12）或Ythdf2CKO（n=11）小鼠皮下注射10^6 MC38細(xì)胞（j）。雄性Ythdf2F/F（n=16）或Ythdf2CKO（n=12）小鼠皮下注射10^6 Hepa1-6細(xì)胞（k）。攜帶腫瘤的小鼠接受抗PD-1或cIg治療。 l. 從接種MC38腫瘤并接受抗PD-1治療的Ythdf2F/F（n=6）和Ythdf2CKO（n=6）小鼠中分離出的TIL，通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估PD-1+Dextramer+、CX3CR1+Tim3+CD101-PD-1+ 的CD8 T細(xì)胞亞群頻率。 （3）YTHDF2通過m6A依賴性RNA衰變預(yù)防T細(xì)胞線粒體功能障礙
圖3：YTHDF2通過m6A依賴性RNA衰變預(yù)防線粒體應(yīng)激和T細(xì)胞耗竭。 a. 在激活的或Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞（抗CD3/CD28，5μg/ml，24小時(shí)）中的差異mRNA表達(dá)基因火山圖（每個(gè)基因型2個(gè)樣本）。顯著上調(diào)或下調(diào)的基因分別用紅色或藍(lán)色點(diǎn)表示。在RIP-seq和m6A-seq中富集的潛在YTHDF2靶標(biāo)用黃色圓圈標(biāo)記。 b. 與Ythdf2F/F CD8 T細(xì)胞相比，在Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞中上調(diào)基因的GO富集分析（抗CD3/CD28，5μg/ml，24h后）。 c. 在激活的Ythdf2F/F（5個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO（5個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞中線粒體膜電位和線粒體質(zhì)量通過MitoTracker Orange（MO）和MitoTracker Green（MG）染色測(cè)量。線粒體健康狀況根據(jù)MO/MG比率評(píng)估。 d. 在Ythdf2F/F（5只小鼠）或Ythdf2CKO（5只小鼠）小鼠中激活的CD8 T細(xì)胞中線粒體活性氧（ROS）通過MitoSOX染色測(cè)量。 e. 在Ythdf2F/F（5只小鼠）和Ythdf2CKO（5只小鼠）小鼠的MC38腫瘤浸潤性CD8 T細(xì)胞中MitoSOX染色。 f. 在Ythdf2F/F（5只小鼠）或Ythdf2CKO（5只小鼠）小鼠的MC38腫瘤浸潤性CD8 T細(xì)胞中MG的MFI定量。 g, h. 在存在10 mΜ NAC或veh的情況下，Ythdf2F/F（5個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO（5個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞（抗CD3/CD28，5μg/ml，48小時(shí)）中Tim3+ PD-1+（g）和Zombie NIR+（h）頻率定量。 i. 熱圖顯示在激活的Ythdf2F/F和Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞中與線粒體相關(guān)且在Ythdf2CKO中上調(diào)的代表性基因相對(duì)表達(dá)。潛在的YTHDF2靶標(biāo)用實(shí)心圓表示。 (4) YTHDF2螯合IKZF1/3以調(diào)控多功能CD8 T細(xì)胞中的活性染色質(zhì)狀態(tài)
圖4：YTHDF2螯合IKZF1/3以調(diào)控多功能CD8 T細(xì)胞活性染色質(zhì)狀態(tài)。 a. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時(shí)）處理后，與Ythdf2F/F相比，Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞中下調(diào)基因的GO富集分析。 b. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時(shí)）或OVA（10nM，24小時(shí)）刺激的小鼠（WT或OT-1）和人類CD8 T細(xì)胞中，YTHDF2與IKZF1或IKZF3相關(guān)聯(lián)的鄰近連接分析（PLA）分析。 c. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時(shí)）處理的WT CD8 T細(xì)胞中，YTHDF2與IKZF1或IKZF3相關(guān)聯(lián)的共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。 d. 在激活的Ythdf2F/F和Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞（抗CD3/CD28，5μg/ml，24小時(shí)）之間，基因的染色質(zhì)可及性差異火山圖。 e. 在Jurkat-shCtrl（Vec）和Jurkat-shYTHDF2（KD）細(xì)胞之間，基因的染色質(zhì)可及性差異火山圖。 f, g. 使用Cistrome Data Browser獲得的小鼠T細(xì)胞中IKZF1（GSM1296538）和IKZF3（GSM803106）的ChIP-seq數(shù)據(jù)集。在IKZF1/3結(jié)合位點(diǎn)或IKZF1/3相關(guān)啟動(dòng)子上，激活的Ythdf2F/F和Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞的ATAC-seq（f）或H3K4me CUT&RUN（g）分析。 h. 在用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時(shí)）處理的激活的Ythdf2F/F（n=3獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO（n=3獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞中，通過RT-qPCR檢測(cè)的Stat5a（左）和Rasgrp1（右）mRNA水平。 i. 在激活的Ythdf2F/F和Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞中，Stat5a（上）和Rasgrp1（下）基因位點(diǎn)上的ATAC-seq和H3K4me CUT&RUN分析。 j. 熱圖顯示在激活的Ythdf2F/F和Ythdf2CKO CD8 T細(xì)胞中，RNA-seq數(shù)據(jù)中代表性基因（Ythdf2CKO中下調(diào)）的相對(duì)表達(dá)。增強(qiáng)的染色質(zhì)可及性或潛在的IKZF1/3結(jié)合用實(shí)心圓表示。 （5）來那度胺挽救YTHDF2缺失型CD8 T細(xì)胞的多功能性
圖5：來那度胺恢復(fù)了YTHDF2缺失的CD8 T細(xì)胞的抗腫瘤功能。 a. 10 μΜ來那度胺（len）或載體對(duì)照（veh）情況下，對(duì)Ythdf2F/F（n=5個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO（n=5個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞進(jìn)行抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時(shí)）刺激，使用Click-it RNA成像分析新生RNA合成（綠色）。 b. 10 μΜ來那度胺或?qū)φ涨闆r下，對(duì)Ythdf2F/F（n=4個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO（n=4個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞進(jìn)行抗CD3/CD28刺激，量化Ki-67 MFI。 c. 10 μΜ來那度胺或?qū)φ涨闆r下，對(duì)Ythdf2F/F;OT-1（n=5個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO;OT-1（n=5個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞進(jìn)行OVA（10nM，24小時(shí)）刺激，使用Click-it RNA成像分析新生RNA合成（綠色）。 d. 10 μΜ來那度胺或?qū)φ涨闆r下，對(duì)Ythdf2F/F;OT-1（n=5個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO;OT-1（n=5個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞進(jìn)行OVA（10nM，72小時(shí)）刺激，量化Ki-67 MFI。 e. 10 μΜ來那度胺或?qū)φ障拢瑢?duì)Ythdf2F/F（n=4個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2CKO（n=4個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞進(jìn)行抗CD3/CD28（5μg/ml，48小時(shí)）刺激，量化Gzm B和IFN-γ MFI。 f. 攜帶MC38腫瘤的Ythdf2F/F（n=21）或Ythdf2CKO（n=18）小鼠接受抗PD-1（250μg/只小鼠）和/或來那度胺（10mg/kg）治療，并監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。 g. 攜帶Hepa1-6腫瘤的Ythdf2F/F（n=12）或Ythdf2CKO（n=12）小鼠接受抗PD-1（250μg/只小鼠）和/或來那度胺（10mg/kg）治療，并監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。 h. 從攜帶Hepa1-6腫瘤的Ythdf2F/F（n=6）或Ythdf2CKO（n=6）小鼠中分離出的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TILs）中，量化Gzm B+ CD8 T或IFN-γ+ CD8 T的頻率，這些小鼠接受抗PD-1（250μg/只小鼠）和/或來那度胺（10mg/kg）治療（第13天）。 （6）YTHDF2依賴于m6A結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行核轉(zhuǎn)位（nuclear translocation）
圖6：m6A修飾機(jī)制調(diào)控YTHDF2的重新定位和表達(dá)。 a. 用或不用ActD（500μg/ml，4小時(shí)）處理的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行YTHDF2與IKZF3相關(guān)PLA分析。 b. 用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時(shí)）刺激的Mettl3F/F或Mettl3CKO CD8 T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中進(jìn)行YTHDF2的免疫印跡分析。 c. 在Jurkat-shCtrl和Jurkat-shMETTL3細(xì)胞中進(jìn)行YTHDF2與IKZF3相關(guān)PLA分析。 d. 用抗CD3/CD28（5μg/ml，24小時(shí)）刺激的Mettl3F/F或Mettl3CKO CD8 T細(xì)胞中進(jìn)行YTHDF2與IKZF3相關(guān)PLA分析。 e. 在引入帶有Flag標(biāo)簽的野生型或突變型YTHDF2的Jurkat細(xì)胞中，進(jìn)行Flag與IKZF3相關(guān)聯(lián)的PLA分析。 f. 在METTL3敲低和對(duì)照J(rèn)urkat細(xì)胞中，有或沒有YTHDF2過表達(dá)（OE）的Ki-67 MFI的定量分析（5個(gè)獨(dú)立樣本）。 g. 在METTL3敲低和對(duì)照J(rèn)urkat細(xì)胞中，有或沒有YTHDF2過表達(dá)（OE）的新生RNA合成的Click-it RNA成像分析（5個(gè)獨(dú)立樣本）。 h. 在na?ve或激活的人類T細(xì)胞（抗CD3/CD28，5小時(shí)）中Ythdf2位點(diǎn)的ATAC-seq軌跡（GSE116696）。 i. 在用或不用抗CD3/CD28（5μg/ml）和ActD（500 μg/ml）刺激24小時(shí)的CD8 T細(xì)胞中，通過qPCR檢測(cè)Ythdf2 mRNA水平（5個(gè)獨(dú)立樣本）。 j. 在na?ve（0小時(shí)）或激活（6小時(shí)）的WT（5個(gè)獨(dú)立樣本）和Ythdf2 ?249（5個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞中通過qPCR檢測(cè)Ythdf2 mRNA水平。 k. Na?ve Ythdf2 ?249（3個(gè)獨(dú)立樣本）和WT（3個(gè)獨(dú)立樣本）CD8 T細(xì)胞用ActD（500μg/ml）處理，并在ActD處理后的不同時(shí)間點(diǎn)收集RNA。通過qPCR檢測(cè)Ythdf2 mRNA水平，并表示為轉(zhuǎn)錄抑制（TI）后剩余的mRNA。 l. 在na?ve（0小時(shí)）或激活（24小時(shí)）的WT與Ythdf2 ?249 CD8 T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中進(jìn)行YTHDF2的免疫印跡分析。 （7）YTHDF2在人類腫瘤浸潤性T細(xì)胞中的表達(dá)和分布。
圖7：人類癌癥中YTHDF2的表達(dá)和分布與T細(xì)胞功能相關(guān)。 a. 小提琴圖比較了根據(jù)單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)得出的高或低多功能性特征分?jǐn)?shù)的CD8 T細(xì)胞中Ythdf2基因表達(dá)水平。左圖，CRC（結(jié)直腸癌），n=10名患者。中間，PDAC（胰腺導(dǎo)管腺癌），n=20名患者。右圖，HCC（肝細(xì)胞癌），n=31名患者。 b. 小提琴圖比較了治療前后應(yīng)答和不應(yīng)答CD8 T細(xì)胞中Ythdf2基因表達(dá)水平。左圖，治療前黑色素瘤，n=19（治療前）或29（治療后）。右圖，HCC，n=31（治療后）。 c. 小提琴圖比較了接受新輔助抗PD-1治療的HCC中生成的CD8 T細(xì)胞簇中Ythdf2基因表達(dá)水平。 d-i. 來自HCC（n=45名患者，d-g）或CRC（n=30名患者，h-k）的經(jīng)治療患者的組織切片被染色為CD8（紅色）、YTHDF2（綠色）和DAPI（藍(lán)色）。 d-h. 來自HCC（d）和CRC（h）患者的切片的代表性免疫熒光圖像，顯示對(duì)新輔助化療（免疫）治療的不同反應(yīng)。虛線框表示底部單獨(dú)通道顯示的4倍放大區(qū)域。白色箭頭指向YTHDF2和CD8陽性細(xì)胞。量化CD8 T細(xì)胞的數(shù)量（e, i），YTHDF2陽性CD8 T細(xì)胞的頻率（f, j）以及CD8 T細(xì)胞中YTHDF2的強(qiáng)度（g, k）。CR，完全反應(yīng)；PR，部分反應(yīng)；SD，疾病穩(wěn)定；PD，疾病進(jìn)展。 研究小結(jié)：本研究通過RIP-seq、RNA-seq、m6A-seq、ATAC-seq等分析揭示了YTHDF2在早期效應(yīng)T細(xì)胞和效應(yīng)樣T細(xì)胞中選擇性上調(diào)和重新分布；YTHDF2缺失加劇了腫瘤進(jìn)展，并對(duì)小鼠和人類的PD-1阻斷治療無反應(yīng)性；YTHDF2通過m6A依賴性RNA衰變預(yù)防線粒體功能障礙；YTHDF2與IKZF1/3互作促進(jìn)T細(xì)胞多功能性；通過聯(lián)合使用IKZF1/3抑制劑來那度胺，可以恢復(fù)YTHDF2缺失T細(xì)胞的免疫治療效果。 本研究結(jié)果表明，YTHDF2通過協(xié)調(diào)表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)來增強(qiáng)T細(xì)胞免疫，可能為治療干預(yù)提供信息。YTHDF2表達(dá)和分布與人類腫瘤中T細(xì)胞功能相關(guān)，可能作為癌癥預(yù)后的臨床指標(biāo)。 研究亮點(diǎn)：
關(guān)于易基因RNA m6A甲基化測(cè)序(MeRIP-seq)技術(shù)易基因MeRIP-seq技術(shù)利用m6A特異性抗體富集發(fā)生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，可以對(duì)RNA上的m6A修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域；可應(yīng)用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m6A檢測(cè)。 大樣本量m6A-QTL性狀關(guān)聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個(gè)樣品價(jià)格高，通常難以承擔(dān)。易基因開發(fā)建立MeRIP-seq2技術(shù)，顯著提成IP平行性，實(shí)現(xiàn)不同樣本間相對(duì)定量，降低檢測(cè)成本。 易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術(shù)：
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
研究方向： m6A甲基化目前主要運(yùn)用在分子機(jī)制的理論性研究
關(guān)于m6A甲基化研究思路 （1）整體把握m6A甲基化圖譜特征：m6A peak數(shù)量變化、m6A修飾基因數(shù)量變化、單個(gè)基因m6A peak數(shù)量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修飾基因的功能分析 （2）篩選具體差異m6A peak和基因：差異m6A peak鑒定、非時(shí)序數(shù)據(jù)的分析策略、時(shí)序數(shù)據(jù)的分析策略、差異m6A修飾基因的功能分析、差異m6A修飾基因的PPI分析、候選基因的m6A修飾可視化展示 （3）m6A甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析：Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)、m6A修飾目標(biāo)基因的篩選策略 （4）進(jìn)一步驗(yàn)證或后期試驗(yàn)
易基因染色質(zhì)可及性-轉(zhuǎn)座酶易接近染色質(zhì)測(cè)序（ATAC-seq） ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）是通過使用高通量測(cè)序?qū)D(zhuǎn)座酶可接近性核染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行分析的一種創(chuàng)新表觀遺傳學(xué)研究技術(shù)。該技術(shù)通過轉(zhuǎn)座酶對(duì)某種特定時(shí)空下開放的核染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行切割，進(jìn)而獲得在該特定時(shí)空下基因組中所有活躍轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。 真核生物的DNA并不是裸露的，而是被包裝成核小體形成串珠狀結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步被折疊、包裝。而基因的轉(zhuǎn)錄，需要將這種高級(jí)結(jié)構(gòu)解開，使DNA成為可以使各種轉(zhuǎn)錄機(jī)器與其結(jié)合的裸露狀態(tài)，即形成開放染色質(zhì)區(qū)域。如何鑒定開放染色質(zhì)區(qū)域呢？傳統(tǒng)的方法主要是借助和DNase-Seq、MNase-Seq及ChIP-seq。但這些方法需要的起始細(xì)胞量較大，對(duì)于少量樣本和珍稀樣本可行性不高。ATAC-Seq是一種新型的研究開放染色質(zhì)的技術(shù)，利用Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)入并切割裸露的DNA，并同時(shí)連接上特異性的測(cè)序接頭。因?yàn)榍懈詈图咏宇^一步完成，因此該技術(shù)可大大降低所需細(xì)胞起始量。 技術(shù)優(yōu)勢(shì)： （1）所需細(xì)胞起始量低。 （2）應(yīng)用范圍廣，適用于大部分物種及細(xì)胞類型。 實(shí)驗(yàn)策略：
信息分析：
易基因提供全面的表觀基因組學(xué)（DNA甲基化、DNA羥甲基化）和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能組學(xué)技術(shù)方案（ChIP-seq、ATAC-seq），詳詢易基因：0755-28317900。
參考文獻(xiàn)：Zhang H, et al. YTHDF2 upregulation and subcellular localization dictate CD8 T cell polyfunctionality in anti-tumor immunity. Nat Commun. 2024 Nov 5;15(1):9559. doi: 10.1038/s41467-024-53997-6. 相關(guān)閱讀：項(xiàng)目文章：MeRIP-seq+RNA-seq揭示家禽(雞)脂肪沉積中的m6A RNA甲基化調(diào)控機(jī)制 項(xiàng)目文章 | MeRIP-seq揭示m6A修飾在肺動(dòng)脈高壓(PAH)發(fā)病機(jī)制中的潛在作用和新治療靶點(diǎn) Nat Commun：ATAC-seq等揭示恒河猴大腦高分辨率解剖區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組和開放染色質(zhì)圖譜 |
|
|
