   在人類與癌癥的斗爭中，每一次技術(shù)的突破都可能為患者帶來新的希望。最近，一項關(guān)于肺癌治療的創(chuàng)新研究引起了科學界的廣泛關(guān)注。科學家們正在嘗試一種創(chuàng)新的方法——利用誘導多能干細胞（iPSC）衍生的細胞外囊泡（EV）攜帶著化療藥物，實現(xiàn)對腫瘤細胞的精準遞送。想要了解這些細胞是如何成為我們對抗肺癌的新武器的嗎？跟隨我們一探究竟吧！  肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。盡管近年來靶向治療和免疫治療取得了顯著進展，但如何進一步提升治療效果并降低系統(tǒng)性毒性，仍是亟待解決的關(guān)鍵問題。EV作為藥物遞送系統(tǒng)，憑借其出色的生物相容性和低免疫原性特性，受到了廣泛關(guān)注。iPSC技術(shù)的發(fā)展，為疾病建模、藥物篩選和個性化醫(yī)療提供了新的平臺。 本研究旨在探索使用iPSC衍生的間充質(zhì)基質(zhì)細胞（MSC）產(chǎn)生的EV作為順鉑的遞送載體。iPSC-MSC來源的EV因具備優(yōu)異的生物相容性和極低的免疫原性，而被視為極具潛力的藥物傳輸媒介。通過將順鉑封裝在這些EV中，研究者希望開發(fā)出一種新的個性化治療方法，以提高藥物的靶向輸送效率并減少副作用，從而為肺癌治療提供一種新策略。 
 1. 從非小細胞肺癌患者來源的肺成纖維細胞生成iPSC 為了從非小細胞肺癌（NSCLC）患者中生成健康的iPSC，研究團隊首先從手術(shù)樣本中獲取健康的肺組織，分離并在體外培養(yǎng)細胞。經(jīng)過確認，這些細胞為正常成纖維細胞，且大部分表達CD90表面標志物。隨后，團隊利用攜帶特定基因的仙臺病毒粒子對健康肺成纖維細胞進行轉(zhuǎn)染，并與小鼠胚胎成纖維細胞共培養(yǎng)，成功誘導出iPSC菌落。 研究選取了來自兩位患者的iPSC克隆進行進一步分析，這些克隆表達多能性因子，并展現(xiàn)出正常的核型。在誘導分化為中胚層、內(nèi)胚層和外胚層的過程中，相關(guān)基因的表達發(fā)生了顯著變化，驗證了這些iPSC克隆的分化潛能。 此外，對iPSC進行檢測發(fā)現(xiàn)，仙臺病毒基因組和部分轉(zhuǎn)基因基因在iPSC克隆中已缺失，但c-MYC轉(zhuǎn)基因在部分克隆中仍持續(xù)存在。盡管如此，從這兩位患者中選擇的iPSC克隆仍顯示出了成功重編程的所有特征，并被認為是功能齊全的。 因此，這些患者來源的iPSC克隆（LC0001 cl16和LC0008 cl20）具有分化為肺類器官和iPSC衍生的間充質(zhì)干細胞（iPSC-MSC）的潛力，可用于后續(xù)研究（圖1）。  圖1 2. iPSC分化為肺類器官，分離出患者來源的肺癌類器官 為生成健康的肺類器官，研究采用商業(yè)試劑盒對LC0001和LC0008的iPSC克隆進行分化。最初，誘導了明確的內(nèi)胚層分化，第1天觀察到單層細胞，第4天出現(xiàn)前腸內(nèi)胚層（AFE）芽，第7天收獲并進行懸浮培養(yǎng)形成球狀結(jié)構(gòu)。隨后，球體被播種到Matrigel三明治培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少42天，形成密集排列的肺類器官，并在第49天形成帶有薄層極化細胞的芽。通過免疫熒光分析，成熟的iPSC衍生的肺類器官表達了多種肺細胞標志。同時，利用肺癌手術(shù)樣本建立了患者匹配的LCO，并表現(xiàn)出NSCLC特異性標志物的強烈表達?？傊?，健康的iPSC衍生的肺類器官和患者匹配的肺癌類器官在體外成功構(gòu)建，可用于后續(xù)的藥物毒性作用研究（圖2）。 圖2 3. iPSC - MSC的生成和表征 為制備iPSC-MSC衍生的EV，研究人員選取了一個患者來源的iPSC克?。‵ib3iPSC cl20，LC0008）進行分化為MSC，并對所得細胞進行了全面表征。在分化過程中，iPSC經(jīng)歷了形態(tài)變化，從緊密排列的菌落轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N體形態(tài)的細胞。完全分化的iPSC-MSC在第35天進行了流式細胞術(shù)分析，結(jié)果顯示其CD90和CD105表達高于親本iPSC克隆，且造血分化標志物陰性，證實了其正確的細胞身份。此外，與iPSC相比，iPSC-MSC中OCT4表達下調(diào)，但仍高于完全分化的成纖維細胞。三譜系分化實驗顯示iPSC-MSC能成功分化為軟骨細胞，脂肪和成骨分化程度較低。細胞活力和細胞毒性分析表明，高濃度順鉑對iPSC-MSC有影響。同時，iPSC-MSC在傳代4至9期間呈指數(shù)增長，適合用于EV的生產(chǎn)和分離（圖3）。 圖3 4. iPSC - MSC衍生EV的表征 為了生成EV，研究人員在T175燒瓶中擴增了患者LC0008的iPSC-MSC（P4-P9），并在更換培養(yǎng)基時收集含有EV的培養(yǎng)基，分離細胞碎片后對EV進行濃縮。順鉑裝載到EV上時，在培養(yǎng)基中加入順鉑48小時，然后按照非裝載EV的方式進行EV分離。采用TEM和dsELISA對EV進行表征，結(jié)果顯示不同分離的EV大小無顯著差異，但裝載順鉑的EV含有更多顆粒/mL（盡管差異無統(tǒng)計學意義）。HPLC分析表明，EV成功裝載了0.07μg/mL的順鉑。dsELISA分析顯示，所有測試樣本中CD63表達水平大致相同，且EV陰性標記物calnexin在分離的EV中不存在，表明EV群體純凈。綜上所述，成功從iPSC-MSC中分離出EV并裝載順鉑，這些EV及未裝載的EV將用于后續(xù)步驟中處理iPSC衍生的BLO和患者匹配的LCO（圖4）。 圖4 5. iPSC衍生的類器官和患者匹配的肺癌類器官暴露于EV 為了評估自體EV裝載順鉑的效果，研究人員對MSC-EV、EV+cispt和順鉑處理后的BLO和LCO進行了RNA分離和RT-qPCR分析，并進行了CCK8和LDH測定以評估細胞毒性。結(jié)果顯示，EV可誘導LCO中LDH釋放，且對BLO有輕微細胞毒性，但不如LCO明顯。順鉑處理有增加LCO代謝活性的趨勢，與凋亡相關(guān)基因上調(diào)一致。然而，CCK8測試顯示，無論是EV還是順鉑治療，都沒有顯著影響LCO和BLO的代謝活性。對凋亡相關(guān)基因的分析顯示，EV+cispt在患者匹配的LCO中輕微上調(diào)了這些基因的表達，但在iPSC來源的BLO中無變化。盡管在LCO中基因表達略有上調(diào)，但LDH實驗未檢測到細胞毒活性。此外，異體EV+cispt暴露增加了FASL基因表達，而自體EV治療對凋亡相關(guān)基因無影響或下調(diào)。20μg/mL順鉑上調(diào)了LCO和BLO中的凋亡相關(guān)基因，但CASPASE-7在LCO中的上調(diào)幅度遠大于BLO（圖5）。 圖5 本研究成功地利用iPSC衍生的肺和肺癌類器官模型，評估了順鉑封裝于自體iPSC-MSC來源的EV中的可行性。這一創(chuàng)新方法有望提高藥物的靶向性，減少系統(tǒng)性毒性，為肺癌患者帶來更為精準的治療方案。 盡管初步實驗顯示，這種新型藥物遞送系統(tǒng)在體外實驗中對肺癌類器官的影響有限，推測可能是由于順鉑封裝量不足所致，但這一發(fā)現(xiàn)無疑為未來肺癌的個性化治療提供了新思路。研究還指出，盡管iPSC-MSC EV作為藥物載體具有巨大潛力，但目前備流程及藥物封裝步驟繁瑣且耗時，一定程度上阻礙了其在個性化醫(yī)療領(lǐng)域的廣泛應用。 最終，研究者們強調(diào)了進一步研究的必要性，以優(yōu)化EV的制備和藥物封裝技術(shù)，從而提升治療效率。本研究的成果為未來的治療策略提供了寶貴的見解，并為肺癌治療領(lǐng)域帶來了一線希望。隨著技術(shù)的不斷進步，我們有理由相信，這種創(chuàng)新療法將為肺癌患者帶來更加光明的未來。 參考文獻 Küstermann C, Narbute K, Mov?ana V, Parfejevs V, Rūmnieks F, Kau?is P, Priedols M, Mikilps-Mikgelbs R, Mihailova M, Andersone S, Dzalbs A, Bajo-Santos C, Krams A, Abols A. iPSC-derived lung and lung cancer organoid model to evaluate cisplatin encapsulated autologous iPSC-derived mesenchymal stromal cell-isolated extracellular vesicles. Stem Cell Res Ther. 2024 Aug 7;15(1):246. doi: 10.1186/s13287-024-03862-6. PMID: 39113093; PMCID: PMC11304910. |
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