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生菜 （Lactuca sativa L.，萵苣屬） 是世界范圍內(nèi)重要的菊科（Asteraceae）蔬菜作物，全球廣泛種植，也是人類植物營(yíng)養(yǎng)素的重要來源?，F(xiàn)代生菜品種根據(jù)形態(tài)特征被分為多個(gè)不同的園藝類型，包括奶油生菜、脆葉生菜、 cos（也稱為羅馬生菜）、散葉生菜、拉丁生菜、莖用生菜和油籽生菜。盡管形態(tài)各異，但不同園藝類型的生菜共有一些共同的馴化特征，如無葉刺、不開裂的種莢和晚期抽薹。生菜被認(rèn)為由單一的野生祖先Lactuca serriola馴化而來，隨后分化成兩種形態(tài)不同的主要蔬菜類型：葉用生菜和莖用生菜。盡管全基因組重測(cè)序研究揭示了生菜馴化過程中的遺傳變異，但表觀遺傳變異在生菜馴化和分化中的作用在很大程度上仍然未知。

近日，新加坡國(guó)立大學(xué)申莉莎團(tuán)隊(duì)繪制了52個(gè)生菜品種的單堿基分辨率DNA甲基化圖譜，包括主要的生菜品種和野生近緣種。通過對(duì)DNA甲基化圖譜、轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性及互作圖譜的多組學(xué)綜合分析揭示了DNA甲基化變化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，為通過表觀遺傳工程改善蔬菜提供寶貴的表觀基因組資源。相關(guān)研究成果以“DNA methylation variations underlie lettuce domestication and divergence”為題發(fā)表在《Genome Biology》期刊上。

標(biāo)題：DNA methylation variations underlie lettuce domestication and divergence（DNA 甲基化變異是生菜馴化和分化的基礎(chǔ)）

發(fā)表時(shí)間：2024-06-17

發(fā)表期刊：Genome Biology

影響因子：IF 10.1 / 1區(qū)

技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq、ATAC-seq（易基因優(yōu)勢(shì)技術(shù)）

為理解生菜馴化和分化的遺傳和表觀遺傳基礎(chǔ)，本研究從52個(gè)生菜品種中生成了單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，包括主要的生菜品種和野生近緣種（wild relatives）。分析結(jié)果表明生菜馴化過程中的DNA甲基化顯著增加，并揭示了與生菜馴化和分化相關(guān)的顯著表觀遺傳變異。特別與葉用生菜和莖用生菜相關(guān)的DNA甲基化變異分別與調(diào)控和代謝過程相關(guān)，而與這兩種類型都相關(guān)的變異則在應(yīng)激響應(yīng)中富集。此外研究還揭示了馴化誘導(dǎo)的DNA甲基化變化可能通過影響染色質(zhì)可及性和染色質(zhì)loop來影響附近和遠(yuǎn)端基因的表達(dá)水平。本研究為作物馴化和分化提供了群體表觀基因組的見解，并為進(jìn)一步的馴化、多樣性和表觀遺傳育種提供了寶貴的資源，以促進(jìn)作物改良。

研究方法

研究使用全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）對(duì)30日齡的幼苗葉片進(jìn)行甲基化測(cè)序，生成不同品種的600Gb全基因組測(cè)序（WGS）數(shù)據(jù)以用于基因組變異calling。還分析了DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性及相互作用圖譜，以揭示DNA甲基化變異對(duì)基因表達(dá)的作用。

結(jié)果圖形：

（1）生菜的DNA甲基化變異

圖1：生菜馴化過程中 CG 甲基化多樣性增加。

1. 野生近緣種（L. serriola、L. virosa、L. indica和L. saligna）和栽培生菜（包括cos、奶油生菜、脆葉生菜和莖用生菜）在種植后2周的幼苗形態(tài)。

2. 基于所有CG位點(diǎn)的甲基化水平構(gòu)建的52個(gè)生菜品種的鄰接加入（neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹。

3. 基于CG甲基化水平對(duì)所有生菜品種進(jìn)行的主成分分析（PCA）。

4. 野生生菜（L. serriola）和栽培生菜（L. sativa）中CG甲基化和單核苷酸多態(tài)性（SNP）變異的多樣性。

（2）生菜馴化過程中的全基因組DNA 甲基化增加

圖2：生菜馴化過程中CG甲基化水平升高。

1. 與野生生菜L. serriola（野生）相比，栽培生菜中CG甲基化水平的增加。

2. 生菜馴化過程中1號(hào)染色體（Chr1）上甲基化水平變化熱圖。

3. 基因（左）和TEs（右）周圍平均CG甲基化水平。

4. DMRs在不同基因組區(qū)域的分布，分為基因體、+2 kb flanking區(qū)域（TSS上游2 kb）、-2 kb flanking區(qū)域（TTS下游2 kb）、TEs和不包括TEs的間隔區(qū)域。下方顯示了整個(gè)基因組中不同基因組區(qū)域的平均分布作為參考。

（3）栽培生菜中甲基化變化的保守性和分化性

圖3：葉用生菜品種間DNA甲基化變化的高相關(guān)性。

1. 相對(duì)于野生生菜L. serriola，不同生菜品種間CG甲基化變化校正。

b-c. 相對(duì)于野生生菜L. serriola，不同生菜品種中共有和特異性高甲基化（b）和低甲基化（c）差異甲基化區(qū)域（DMRs）。

d. 熱圖顯示在葉用生菜中發(fā)現(xiàn)的類型特異性高甲基化和低甲基化DMRs的甲基化水平。葉用生菜包括cos、奶油生菜（黃油）和脆葉生菜。灰色塊表示在葉用生菜和莖用生菜之間顯示出顯著差異甲基化水平的DMRs。左側(cè)面板展示了LsAMY1（Lsat_1_v5_gn_6_112060）上的一個(gè)高保真葉用特異性高甲基化DMR示例，以及LsIQD31（Lsat_1_v5_gn_3_102080）上的一個(gè)高保真葉用特異性低甲基化DMR示例。甲基化譜圖上方顯示的是LsAMY1和LsIQD31的基因結(jié)構(gòu)，其中藍(lán)色和黃色框分別表示外顯子和非翻譯區(qū)，紫色線表示內(nèi)含子和其他基因組區(qū)域。

e. 與這些高保真葉用特異性DMRs相關(guān)聯(lián)的基因的基因本體（GO）富集分析。

（4）莖用生菜的單獨(dú)進(jìn)化

圖4：?jiǎn)为?dú)變化的莖用生菜中的DNA甲基化。

1. 熱圖顯示了相對(duì)于野生生菜L. serriola，莖用生菜的特異性高甲基化和低甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）的甲基化水平?；疑珘K中的DMRs顯示了葉用和莖用生菜之間的顯著差異，代表了高保真度的莖特異性DMRs。

2. 野生生菜L. saligna中高保真度莖特異性DMRs的甲基化水平。

3. 在L. saligna和莖用生菜中觀察到的高保真度莖特異性DMRs中具有相同SNPs區(qū)域的富集。

4. 與高保真度莖特異性DMRs相關(guān)的基因的GO富集分析。

（5）馴化誘導(dǎo)的DMR與脅迫響應(yīng)有關(guān)

圖5：生菜品種共有的馴化誘導(dǎo)DMRs。

1. 熱圖顯示了生菜品種共有的高甲基化和低甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）的甲基化水平。

b-c. 與共有高甲基化（b）和低甲基化DMRs（c）相關(guān)的基因的GO富集分析。圖表顯示了得分最高的10個(gè)生物學(xué)過程。

d. 在共有馴化誘導(dǎo)DMRs中富集的DNA motifs（上圖）與已發(fā)表數(shù)據(jù)集中3XHMG-BOX1和ERF48的結(jié)合位點(diǎn)的motifs相似（下圖）。E值（e）表示MEME預(yù)計(jì)的motifs數(shù)量，而Q值（q）表示隨機(jī)motifs具有與目標(biāo)motifs最優(yōu)比對(duì)概率。

e. 在ERF48結(jié)合motifs 10kb內(nèi)的共有DMRs密度?；疑€表示隨機(jī)基因組區(qū)域。

f. 在基因10kb內(nèi)的ERF48結(jié)合motifs密度。

（6）馴化誘導(dǎo)的DNA甲基化變異通過順式或反式作用影響基因表達(dá)

圖6：馴化誘導(dǎo)的DNA甲基化變化通過順式或反式作用效應(yīng)基因表達(dá)變化。

1. Meta圖顯示基因附近（左圖）和遠(yuǎn)離基因（右圖）的生菜品種共有馴化誘導(dǎo)DMRs的染色質(zhì)可及性。星號(hào)表示DMRs的染色質(zhì)可及性與整個(gè)基因組相比的顯著差異。

2. 與所有基因相比，莖用生菜與野生生菜L. serriola之間DMR相關(guān)近端基因（DPGs）和遠(yuǎn)端基因（DDGs）的基因表達(dá)變化（絕對(duì)值）增加。

3. 甲基化變化（Chr1: 59,076,400–59,077,800；上圖和下圖中的中間箱線圖）與近端基因（DPG: Lsat_1_v5_gn_1_50480；下圖中的右側(cè)箱線圖）和遠(yuǎn)端基因（DDG: Lsat_1_v5_gn_1_50600；下圖中的左側(cè)箱線圖）相關(guān)示例，它們位于一個(gè)染色質(zhì)loop中，物理距離超過64 kb。中間圖顯示這些基因的結(jié)構(gòu)，其中藍(lán)色和黃色框分別表示外顯子和非翻譯區(qū)，紫色線表示內(nèi)含子和其他基因組區(qū)域?？蛏系牟煌帜副硎境蓪?duì)比較中的顯著差異。

易小結(jié)：

本研究揭示了主要栽培生菜和野生近緣種之間的表觀基因組變異，為生菜馴化和分化過程中基因調(diào)控的表觀遺傳進(jìn)化提供了重要見解。這些已鑒定的表觀等位基因是促進(jìn)未來對(duì)生菜馴化和分化的功能基因組研究以及表觀遺傳育種的寶貴資源，以提高生菜產(chǎn)量和抗逆性，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)。

• 表觀遺傳學(xué)在作物馴化中的作用：這項(xiàng)研究揭示了DNA甲基化在生菜馴化和分化中的重要作用，這是之前未被充分探索的領(lǐng)域。

• 單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜：研究提供了52個(gè)生菜品種的高分辨率DNA甲基化圖譜，為深入理解表觀遺傳變異提供了基礎(chǔ)。

• 表觀遺傳變異與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)：研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化變異可能通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)控基因表達(dá)，這對(duì)于理解作物馴化的分子機(jī)制具有重要意義。

• 為作物改良提供資源：本研究不僅增進(jìn)了對(duì)生菜馴化的理解，還為未來的表觀遺傳育種和作物改良提供了寶貴的資源。

關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）

全基因組重亞硫酸鹽甲基化測(cè)序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測(cè)所有單個(gè)胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時(shí)空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個(gè)體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機(jī)制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

易基因全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進(jìn)而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。

應(yīng)用方向：

WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯(cuò)過關(guān)鍵位點(diǎn)）

• 全基因組甲基化圖譜課題

• 標(biāo)志物篩選課題

• 小規(guī)模研究課題

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；

• 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；

• 單堿基分辨率：可精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)。

易基因提供全面的表觀基因組學(xué)（DNA甲基化、DNA羥甲基化）和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能組學(xué)技術(shù)方案（ChIP-seq、ATAC-seq），詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻(xiàn)：

Cao S, Sawettalake N, Li P, Fan S, Shen L. DNA methylation variations underlie lettuce domestication and divergence. Genome Biol. 2024 Jun 17;25(1):158. pii: 10.1186/s13059-024-03310-x. doi: 10.1186/s13059-024-03310-x. PubMed PMID: 38886807.

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