之前一直從事工作是體外生物實驗，當(dāng)接觸到體內(nèi)實驗比如PK&PD，難免心里總存在很多的疑問，你是否也這樣呢？

今天要講述的是：如何通過體外小分子藥物活性（例如細(xì)胞實驗或者酶活實驗的IC50等）確定動物體內(nèi)藥效劑量？或者說如何將體外、體內(nèi)兩者聯(lián)系起來。

為確保我們可以扎實的掌握此知識，將通過兩個方面分享：

一、基礎(chǔ)知識

1.體外實驗

2.PPB血漿蛋白結(jié)合率

3.PK

4.PD

5.PK-PD

二、實驗動物給藥劑量確定方法

1. 基礎(chǔ)知識

1. 體外實驗：

    體外試驗主要用于篩選候選化合物，初步了解受試物的作用機(jī)制、敏感腫瘤類型和作用強(qiáng)度，為隨后進(jìn)行的體內(nèi)試驗提供參考。

    針對細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物的體外活性一般會通過生化或腫瘤細(xì)胞增殖實驗檢測受試物的靶向性、敏感腫瘤類型和作用強(qiáng)度，為隨后進(jìn)行的體內(nèi)試驗提供參考。以同一樣品的不同濃度對酶活腫瘤細(xì)胞生長抑制率獲得的結(jié)果得到劑量依賴曲線，計算半抑制濃度IC50，或80%抑制濃度IC80來獲得藥物體外活性。一般合成化物或植物提取純品的IC50<10ug/mL，則判斷藥物在體外有抑制作用。

    計算公式：抑制率%=（1-OD實驗/OD對照）x 100%

• 一般情況下，只有游離型藥物才能通過脂膜向組織擴(kuò)散，被腎小管濾 過或被肝臟代謝，因此藥物與蛋白的結(jié)合會明顯影響藥物分布與消除的動 力學(xué)過程，并降低藥物在靶部位的作用強(qiáng)度。
  

• 由于生化實驗一般是化合物與酶直接反應(yīng)，反應(yīng)的是100%游離態(tài)化合物的活性。

• 對于細(xì)胞類實驗，細(xì)胞培養(yǎng)時一般需要加10%FBS（胎牛血清）所以在加藥物處理后，一部分化合物會與培養(yǎng)基中的血清蛋白結(jié)合，另一部分未結(jié)合的游離化合物進(jìn)入細(xì)胞與靶蛋白結(jié)合。因此得到的IC50值需要經(jīng)過血漿蛋白結(jié)合率折算。但這個只是其中一種考量方法。

2. PPB(plasma protein binding)血漿蛋白結(jié)合

• 許多藥物能夠與血漿蛋白、組織蛋白、脂肪或體內(nèi)大分子物質(zhì)結(jié)合（如DNA、酶、粘多糖等反應(yīng)）生成藥物-蛋白復(fù)合物，不能透過血管進(jìn)入組織發(fā)揮藥效。

• 血液中藥物存在形式：游離型、血漿蛋白結(jié)合型；只有游離型藥物才能從血液向組織轉(zhuǎn)運，并在作用部位發(fā)揮藥理作用.

• 常見的結(jié)合蛋白：

• 白蛋白(albumin)：占血漿蛋白總量的60%；可結(jié)合大多數(shù)酸性藥物和一些堿性藥物

• α1酸性糖蛋白(alpha acid glycoprotein)

• 脂蛋白（lipoprotein）：主要與堿性和中性藥物結(jié)合

• 藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合：

• 氫鍵和范德華力，

• 可逆性、飽和性、競爭性
  

• 動態(tài)平衡，

• 可作為藥物儲庫：如果儲存部位是藥理作用的部位，就可能延長作用時間；若不是靶向部位則可能可能產(chǎn)生毒性。

• 置換現(xiàn)象：對于一些結(jié)合率高的藥物，與另一種與其競爭使結(jié)合率下降的藥物作用，可使游離型藥物大量增加，改變ADME和藥效。（但較少考慮此辦法）

• 藥物-蛋白復(fù)合物影響藥效：

• 不能透過血管壁向組織轉(zhuǎn)運、

• 不能由腎小球濾過排泄、

• 不能經(jīng)肝代謝。以此影響藥物的體內(nèi)分布，藥物的代謝和排泄。

• 藥物與蛋白結(jié)合的影響因素：
• 藥物的理化性質(zhì)：油水分配系數(shù)、擴(kuò)散
• 給藥劑量：競爭抑制
• 藥物與蛋白質(zhì)的親和力：
• 藥物相互作用
• 動物物種差異：較大（采用牛血清白蛋白研究藥物蛋白結(jié)合率，不能正確反映藥物與人血漿蛋白的結(jié)合）
• 性別差異：雌性體內(nèi)白蛋白的濃度高于雄性，水楊酸高于雄性
• 生理和病理狀態(tài)：年齡、肝腎功能不良，血漿蛋白量降低，血中游離型藥物濃度高。
  
  
  

3. PK (pharmacokinetics )藥代動力學(xué) :

    反映藥物在體內(nèi)動態(tài)變化規(guī)律性的一些常數(shù)，定量描述了藥物在體內(nèi)經(jīng)時過程的動力學(xué)特點及作用變化規(guī)律。

    在小鼠靜脈注射或口服藥物后的不同時間點采集小鼠血液進(jìn)行LC-MS分析（利用液相色譜（LC）和質(zhì)譜（MS）相結(jié)合的分析方法），已確定血液中藥物含量。繪制藥物濃度與時間的關(guān)系圖，并根據(jù)PK試驗結(jié)果計算藥代動力學(xué)參數(shù)。

     今日話題所涉及主要關(guān)于血藥濃度-時間曲線 --單次給藥：

    3.1 受試動物數(shù)：一般每個劑量可選擇3只進(jìn)行預(yù)實驗，在正式實驗中每個采樣點不少于 5 個，從同一動物個體多次取樣，建議受試動物采用雌雄各半。

    3.2 采樣點：采樣時間點的設(shè)計應(yīng)兼顧藥物的吸收相、平衡相（峰濃度附近）和消除相。一般在吸收相至少需要 2~3 個采樣點，對于吸收快的血管外給藥的藥物，應(yīng)盡量避免第一個點是峰濃度（Cmax）；在 Cmax 附近至少需要 3 個采樣點；消除相需要 4~6 個采樣點。整個采樣時間至少應(yīng)持續(xù)到 3~5 個半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為 Cmax 的 1/10~1/20。

• 針對血管外給藥，例如灌胃PO，一般采樣時間點可設(shè)置為：15min,30min,1h,2h,4h,6h,8,h,12h（具體實驗具體分析）
  

• 對于靜脈注射給藥，應(yīng)提供T1/2（消除半衰期）、Vd（表觀分布容積）、AUC（血藥濃度-時間曲線下面積）、CL （清除率）等參數(shù)值；

3.3 劑量選擇：動物體內(nèi)藥代動力學(xué)研究應(yīng)設(shè)置至少三個劑量組，其高劑量最好接近 最大耐受劑量，中、小劑量根據(jù)動物有效劑量的上下限范圍選取。

• 
  

    重要的PK參數(shù)含義，反映藥物吸收的規(guī)律。

• Cmax（達(dá)峰濃度） : 給藥后出現(xiàn)的血藥濃度最高值，反應(yīng)藥物在體內(nèi)吸收速率和吸收速度的重要指標(biāo)。

• Tmax（達(dá)峰時間）：藥后到達(dá)峰濃度所需的時間，反應(yīng)藥物進(jìn)入體內(nèi)的速度，吸收速度快則達(dá)峰時間短。

• AUC（血藥濃度-時間曲線下面積）：血藥濃度曲線對時間軸所包圍的面積。該參數(shù)是評價藥物吸收程度的重要指標(biāo)，反映藥物在體內(nèi)的暴露特性。

AUC0-t : 0時刻至最后一個可測時刻t的藥時曲線下面積，根據(jù)梯形面積法得到
AUC0-∞：0時刻至正無窮大時刻的藥時曲線下面積，AUC(0-∞) = AUC(0-t) ＋Ct /λ z

（t 為最后一次可實測血藥濃度的采樣時間；Ct為末次可測定樣本藥物濃度；λ z (末端消除速率)：末端相的血藥濃度消除速率常數(shù)。將血藥濃度取對數(shù)，對時間作線性回歸后所得斜率值的負(fù)數(shù)為末端消除速率）。

• T1/2（末端消除半衰期）：藥物達(dá)到分布平衡后的血藥濃度減少50%所需的時間，而不是血藥濃度下降50%所需的時間。反映了藥物從體內(nèi)的消除速度。末端消除半衰期在數(shù)值上與末端消除速率成反比，即: 末端消除半衰期t_1/2=0.693/末端消除速率λ z。半衰期數(shù)值越大，表示藥物消除或分布過程越慢。t_1/2=0.693/λ z=(0.693*Vd)/CL
• 半經(jīng)典的單隔室 PK 模型：以靜脈給藥或口服給藥方式給藥后，機(jī)體以一級速率（ka）吸收，且吸收速度比一階消除速度更快的條件下，即消除常數(shù) (λ z) 決定終末t_1/2。
• 當(dāng)進(jìn)入組織的藥量=回到血中的藥量，此時血藥水平只因代謝和排泄消除而下降，可以將終末期對應(yīng)為一種偽分布平衡狀態(tài)（pseudo-equilibrium of distribution）。只有達(dá)到偽平衡時，藥物的處置曲線才會變?yōu)閱沃笖?shù)型。此時，體內(nèi)的剩余藥量的終末半衰期也等于剩余藥量的消除半衰期（已經(jīng)沒有吸收和分布的因素）。
• 在藥物處置的終末階段（偽平衡狀態(tài)），藥物衰減一級呈指數(shù)級模式，終末半衰期用 t_1/2=0.693/λz 表示，其中 0.693 是 2 自然對數(shù)（In2=0.693），λ z即消除常數(shù)kel或半對數(shù)曲線終末相的斜率。
• Vd（表觀分布容積）:藥物在體內(nèi)達(dá)到動態(tài)平衡時體內(nèi)藥量與血藥濃度的比例常數(shù)，單位一般為L。反映了藥物在體內(nèi)分布廣窄的程度，數(shù)值越高表示分布越廣。表觀分布容積在數(shù)值上由清除率CL與末端消除速率λ z 的比值得到。 Vd=CL/λ z
• CL （清除率）：腎在單位時間（一般用每分鐘，min）內(nèi)能將多少毫升血漿中所含的某些物質(zhì)完全清除出去，這個被完全清除了某物質(zhì)的血漿毫升數(shù)就稱為該物質(zhì)的清除率（ml/min）。反映機(jī)體對藥物處置特性的重要參數(shù)，與生理因素有密切關(guān)系。清除率根據(jù)劑量與AUC(0-∞)的比值得到。CL=dose/AUC(0-∞)

• MRT（平均駐留時間）：藥物分子在體內(nèi)停留時間的平均值，表示從體內(nèi)消除63.2%藥物所需要的時間。當(dāng)藥動學(xué)過程具有線性特征時才能計算該參數(shù)，其數(shù)值通過AUMC(藥物與時間乘積對時間t的積分)與AUC(0-∞)的比值得到。

• F（生物利用度）：藥物被吸收進(jìn)入血液循環(huán)的速度和程度的一種量度，是評價藥物吸收程度的重要指標(biāo)。（通常認(rèn)為靜脈注射利用度為 100%）

• 絕對生物利用度：用于比較兩種給藥途徑的吸收差異。

  計算公式為: F = (AUC_extDose)/(AUC_ivDose)100%，其中ext表示血管外給藥，iv表示靜注給藥，Dose為劑量。

• 相對生物利用度，用于評價兩種制劑的吸收差異，

  計算公式為: F = (AUC_TDose)/(AUC_R*Dose)*100%，其中T和R分別為受試制劑和參比制劑。

4. PD(pharmacodynamics)藥效動力學(xué)

主要研究內(nèi)容：

4.1藥物效應(yīng)動力學(xué)：

研究藥物對機(jī)體的作用及作用機(jī)制，包括藥物與受體的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

4.2 藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系


描述藥物劑量與效應(yīng)之間的關(guān)系，包括量效曲線、最大效應(yīng)等


4.3 藥物時間-效應(yīng)關(guān)系


描述藥物作用時間與效應(yīng)之間的關(guān)系，包括失效曲線、達(dá)峰時間等。


5. PK-PD結(jié)合模型


將PK模型和PD模型結(jié)合起來，綜合考慮藥物在體內(nèi)的代謝過程和對機(jī)體的作用，更準(zhǔn)確地預(yù)測藥物的療效和安全性。


(由于內(nèi)容太多先不細(xì)講)

6. 確定動物體內(nèi)藥效劑量方法

6.1. 查文獻(xiàn)或?qū)＠?span>參考化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的已知藥物，特別是化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用都相似的藥物的劑量。

6.2. 通過其他動物換算

有一些藥物可能只能查到人或大動物如猴子的數(shù)據(jù)，可以通過體表面積計算法進(jìn)行換算得到所需動物的給藥劑量。確定動物給藥劑量時，要考慮因給藥途徑不同，耐受程度不同，所用劑量也不同。

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 換算方法：體表面積法

先講一下方法的原理：


目前大多數(shù)人用的方法是參考徐叔云教授主編《藥理實驗方法學(xué)》：

體表面積經(jīng)驗公式：體表面積S（m²）=體型系數(shù)R×體重W（kg）^2/3

不同動物有不同的體型系數(shù)R：



 因此D_B=D_A×A_B÷A_A=D_A×（R_B×W_B^2/3）÷（R_A×W_A^2/3）=D_A×(S_B÷S_A)

 D:用藥劑量、A：體表面積、R:體型系數(shù)、S：體表面積

各動物在固定體重時體表面積比值：



使用方法：由A動物折算B動物的藥物劑量，則先在左列找到A動物，再在上行找到B動物，二者交叉處即是A、B兩種動物體表面積的比值。

例如:某藥物的人體給藥劑量為100mg/kg，試計算小鼠的給藥劑量應(yīng)為多少？


①查表：人A與小鼠B的體表面積比值為0.0026

②換算：100mg/kg X 70kg = 7000mg，

③計算：7000mg X 0.0026 ÷ 20g = 910mg/kg


因此小鼠的給藥劑量為910mg/kg


于是為方便計算有人總結(jié)得出不同動物間等效劑量比值：

誤差屬于數(shù)值修約導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差



例如:某藥物的人體給藥劑量為100mg/kg，試計算小鼠的給藥劑量應(yīng)為多少？

①查表：當(dāng)人體體重按60kg計算時，人與小鼠間等效劑量比值為8.51

②計算：100mg/kg X 8.51 = 851mg/kg

因此小鼠的給藥劑量為851mg/kg

所以以后再進(jìn)行動物間折算時可以先查兩種動物的等效劑量比值，再進(jìn)行劑量轉(zhuǎn)換。


注意：

1. 各種動物對某藥的敏感程度不一樣，上述的折算關(guān)系中，沒有考慮到種屬差異，因為大動物相對于小動物更敏感，因此在實際計算中可以選擇10%的安全系數(shù)。

例如:某藥物的人體給藥劑量為100mg/kg，試計算小鼠的給藥劑量應(yīng)為多少？

①查表：當(dāng)人體體重按60kg計算時，人與小鼠間等效劑量比值為8.51

②計算：100mg/kg X 8.51 ÷ 10% = 8510mg/kg

2. 動物的體重需要接近表中標(biāo)注的體重，偏差較大時會導(dǎo)致計算不準(zhǔn)確。最好按照公式D_B=D_A×A_B÷A_A=D_A×（R_B×W_B^2/3）÷（R_A×W_A^2/3）計算。（ D:用藥劑量、A：體表面積、R:體型系數(shù)（見表1））

3. 不同的書籍的等效劑量比值可能有些許不同

6.3 通過PK結(jié)果確定

先按照經(jīng)驗選擇高、中、低三個劑量，進(jìn)行PK得到三個不同劑量的AUC0-t 。將體外活性結(jié)果EC50或EC80換算成血藥濃度ug/mL，而后根據(jù)與三個劑量的交點以及要選擇QD還是BID確定粗略估計藥效起始濃度。



6.4 劑量摸索方法

在觀察一個藥物的作用時，應(yīng)該給動物多少的劑量是實驗開始時應(yīng)確定的一個重要問題。劑量太小，作用不明顯，劑量太大，可能引起動物中毒致死，可以按下述方法確定劑量：

　　1．先用小鼠粗略地探索中毒劑量或致死劑量，然后用小于中毒量的劑量，或取致死量的若干分之一為應(yīng)用劑量，一般可取1/10-1/5。

　　2．植物藥粗制劑的劑量多按生藥折算。

　　3．化學(xué)藥品可參考化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的已知藥物，特別是化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用都相似的藥物的劑量。

　　4．確定劑量后，如第一次實驗的作用不明顯，動物也沒有中毒的表現(xiàn)（體重下降、精神不振、活動減少或其他癥狀），可以加大劑量再次實驗。如出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，作用也明顯，則應(yīng)降低劑量再次實驗。在一般情況下，在適宜的劑量范圍內(nèi)，藥物的作用常隨劑量的加大而增強(qiáng)。所以有條件時，最好同時用幾個劑量作實驗，以便迅速獲得關(guān)于藥物作用的較完整的資料。如實驗結(jié)果出現(xiàn)劑量與作用強(qiáng)度之間毫無規(guī)律時，則更應(yīng)慎重分析。

        5．用大動物進(jìn)行實驗時，開始的劑量可采用給鼠類劑量的十五分之一～二分之一，以后可根據(jù)動物的反應(yīng)調(diào)整劑量。

        6. 確定動物給藥劑量時，要考慮因給藥途徑不同，所用劑量也不同，以口服量為100時，灌腸量應(yīng)為100-200，皮下注射量30-50，肌肉注射量為25-30，靜脈注射量為25。                             

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