在典型的運動癥狀出現(xiàn)之前，非運動癥狀可存在數(shù)年。PD的非運動癥狀非常廣泛，涉及多個系統(tǒng)，包括嗅覺減退、精神行為異常、節(jié)律異常(白天過度嗜睡)、自主神經(jīng)異常、胃腸道功能紊亂、體重減輕等。VMAT2轉(zhuǎn)基因小鼠可以復(fù)制一些PD樣非運動癥狀，為PD非運動癥狀研究提供潛在模型。

百草枯（Paraquat，PQ）是一種高效、價格低廉的廣譜除草劑，結(jié)構(gòu)與MPTP活性代謝產(chǎn)物MPP⁺類似，存在導(dǎo)致PD發(fā)生的可能。代森錳（Maneb，Mb）是一種殺菌劑，治療多種作物病害。研究發(fā)現(xiàn)，代森錳對運動活動和攻擊性行為有抑制作用，而且其與百草枯聯(lián)合使用可增強(qiáng)百草枯的神經(jīng)毒性。流行病學(xué)研究顯示，PQ+Mb聯(lián)合暴露可大大增加人類患PD的風(fēng)險。PQ+Mb聯(lián)合暴露大鼠或小鼠已成為廣泛使用的PD動物模型。近年來，研究發(fā)現(xiàn)PQ+Mb聯(lián)合暴露不僅損傷實驗動物運動功能，還誘導(dǎo)多種非運動癥狀發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，PQ+Mb聯(lián)合處理大鼠可以引起焦慮和類似抑郁的非運動癥狀。聯(lián)合暴露PQ+Mb會損傷SD大鼠的認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶能力。

C57BL/6J出生6-8周雄性小鼠80只，均為SPF級，小鼠隨機(jī)分組為四組，室溫23-26℃，自由飲水進(jìn)食，晝夜等時循環(huán)光照。80只成年SPF級雄性C57BL/6J小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，按體重隨機(jī)分為對照組（Con）、模型組（PQ+Mb）、DSP4處理組（DSP4+PQ+Mb）和單獨DSP-4組（DSP4-alone），每組20只。百草枯（PQ）與代森錳（Mb）分別按照10mg/kg、30mg/kg劑量對模型組和DSP-4處理組小鼠進(jìn)行腹腔注射染毒，2次/周，連續(xù)4周，建立帕金森小鼠模型。雖然PQ(10mg/kg)和Mb(30mg/kg)在實驗動物中的劑量高于人類環(huán)境暴露，但中毒動物在一定程度上模擬了PD的臨床和病理特征，如中毒動物表現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性喪失，腦內(nèi)α-突觸核蛋白沉積，并出現(xiàn)L-左旋多巴可減輕的運動障礙等。DSP-4處理組小鼠在PQ+Mb染毒前一周，腹腔注射一次DSP-4，劑量為50mg/kg。對照組和單獨DSP-4組分別給予同等劑量的溶劑和DSP-4。染毒結(jié)束后分別利用步態(tài)測量、糞便收集、強(qiáng)迫游泳和水迷宮實驗記錄小鼠的運動功能、便秘、抑郁和學(xué)習(xí)、記憶能力。

非運動行為評估

• 糖水偏好實驗

第一天，單籠放置小鼠，給予100ml同樣的飲用自來水。水瓶特殊定制，確保不漏水影響測量結(jié)果。第二天，其中一瓶自來水換為1%蔗糖溶液。為了減少小鼠位置偏好造成的測量誤差，每隔12h對調(diào)自來水和蔗糖溶液的位置。第3天（測試階段），給予100ml的自來水和蔗糖溶液，分別記錄總重，12h對調(diào)位置，24h后再次稱量自來水和蔗糖溶液總重。糖水偏好百分比用24h糖水消耗總量/24h液體消耗總量表示。

• 懸尾實驗

用膠帶將小鼠尾懸掛于距地面50cm的水平桿上，水平桿下方放置鼠籠及墊料防止小鼠摔傷。每次測量持續(xù)7分，視頻記錄小鼠7分內(nèi)情況，記錄分析后6分內(nèi)小鼠不動不掙扎的時間。每只小鼠測試3次，取平均值。

小鼠懸尾箱，型號：XR-XX203，上海欣軟

• 排便實驗

小鼠提前12小時禁食，不禁水，次日到時間觀察每只小鼠1小時內(nèi)排便情況。每只小鼠被放置在一個單獨的干凈籠子里，在整個收集過程中觀察60分鐘，排出后立即收集到的顆粒，放入密封的（以避免蒸發(fā)）1.5毫升的管子，稱重以獲得糞便的濕重，然后在65攝氏度干燥24小時，然后稱重以獲得干重。

• 強(qiáng)迫游泳實驗

找一個2L的透明燒杯放入水溫約25℃的水18cm，將小鼠放入水中觀察5分鐘內(nèi)掙扎次數(shù)和時間。每只小鼠做完項目后要用毛巾擦干，并且把水換掉。注意：如果小鼠在沒有任何運動的情況下漂浮，除了保持鼻子高于水所需的時間外，作為“不動”的時間進(jìn)行編碼。如果觀察到前肢的快速運動以致前爪斷裂水面，則將其作為“掙扎/攀爬”的持續(xù)時間。如果觀察到前肢或后肢以劃槳的方式運動，則將其作為“游泳”的時間。

• 水迷宮檢測方法

水迷宮直徑大約110cm，高70cm。逃生平臺是直徑大約15~20厘米玻璃圓柱體，放置在水池的一個象限的中心，離水池邊緣15厘米，淹沒在水面下1厘米。水溫控制在（23±2）℃，測試期間保持屋內(nèi)物品位置固定不變作為參照。

Morris水迷宮，型號：XR-XM101，上海欣軟

正式測試前要對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練。接受訓(xùn)練的小鼠要從背離平臺除平臺所在象限的其余三個現(xiàn)象入水。在小鼠被釋放后，研究人員從池中撤退到房間內(nèi)一個固定的位置，作為一個額外的遠(yuǎn)距離視覺提示。利用軟件將最大游泳時間設(shè)置為90s。如果小鼠在90s之前找到平臺，它就會立即從水池中移除。如果小鼠在游泳90s后未找到平臺，則將小鼠輕輕地引導(dǎo)到平臺上，并允許在尋找平臺之前在平臺待20s。

為了評估空間參考記憶，在定位航行結(jié)束一天后進(jìn)行空間探索測試。在探索試驗中，將平臺從水池中移除，允許小鼠自由游泳1分鐘。然后再將所有小鼠從同一位置入水，利用VisuTrack軟件將最大游泳時間設(shè)置為60s。記錄其首次穿越平臺的時間（超過60s以60s計）、穿越原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)及在平臺所在象限的游泳時間和距離。